本发明专利技术涉及一种乙型肝炎病毒核苷类似物耐药相关突变检测试剂盒，特别是涉及使用ＤＮＡ反向斑点杂交技术，快速准确地区分临床血液样品中野生型和（或）核苷类似物耐药相关突变型乙型肝炎病毒的检测试剂盒。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种乙型肝炎病毒核苷类似物耐药相关突变检测试剂盒，特别是涉及使用DNA 反向斑点杂交技术，快速准确地区分临床血液样品中野生型和(或)核苷类似物耐药相关突 变型乙型肝炎病毒的检测试剂盒。
技术介绍
乙型肝炎病毒(HBV)是引起病毒性肝炎的主要病原体。由HBV所引起的乙型肝炎是 一种危害严重的传染性疾病。目前，全世界慢性HBV感染者至少有3.5亿，而中国作为乙型 肝炎的高发流行区，约占总人口9%左右的人群(约1.2亿)为慢性HBV感染者。持续慢性 HBV感染在临床上可表现为各种不同类型的疾病，包括无症状携带状态、急或慢性肝炎、肝 硬化等，严重的可能发展为原发性肝癌(HCC)。目前全世界每年有120万人死于HBV感染 引起的疾病。。研究证明，持续高载量HBV是慢性乙肝病情进展和发展为肝硬化和肝细胞癌(HCC) 的主要病因，因此慢性乙肝的治疗应着手于长期抑制或清除病毒。目前用于抗HBV治疗的药 物有干扰素和核苷类似物两大类，核苷类似物则是近年发展最快的抗病毒药物。截至目前， 美国FDA批准可用于治疗乙肝的核苷类似物药物主要有拉米夫定、阿德福韦、恩替卡韦、替 比夫定和依曲西他平，克拉夫定仍处于试验阶段，临床一线药物以拉米夫定、阿德福韦和恩 替卡韦为主。据研究，大部分乙型肝炎病毒中耐药突变主要集中在病毒DNA聚合酶序列，其中在不 同药物的选择压力下产生的耐药突变不尽相同，简述如下拉米夫定(LAM)耐药突变主要集中在病毒DNA聚合酶的酪氨酸-甲硫氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸(YMDD)基序，表现为编码甲硫氨酸的核苷酸发生碱基替代(ATG—ATT/GTG)， 从而使其编码的氨基酸发生相应的变化(M—I/V, rtM204I/V)。阿德福韦(ADV)耐药集中在 HBV多聚酶D区N236T和B区A181V等位点，rtV173L位点变异也对阿德福韦耐药产生一 定的协同作用；同时，据报道发现一例rtA181S变异与阿德福韦耐药相关，rtA181S+N236T 联合变异对拉米夫定与阿德福韦联合治疗敏感性较差。根据目前的资料证明，在YMDD突变 基础上，加上以下耐药突变位点T184G、 S202I、 M250V之一，即可发生恩替卡韦(ETV) 耐药。因此，ETV的耐药突变只发生在LAM耐药的患者中，提示ETV治LAM耐药的患者，有可能发生ETV耐药突变。替比夫定(LdT)在治疗过程中，亦可出现YMDD突变耐药， 治疗52周后，出现突变耐药率为2/44 (4.5%)，主要突变表型为M204I和L180M+M204V， 与LAM有交叉耐药。据报道依曲西他平(FTC)治疗48周后，YMDD突变耐药率达12.6%， 与LAM交叉耐药。目前国内外的乙型肝炎病毒耐药基因突变检测试剂盒检测的变异位点一般为rtL180M、 rtA181V、 rtM204V和rtN236T等与拉米夫定及阿德福韦耐药相关位点，虽然也能覆盖部分乙 肝耐药患者群，但存在一定的漏检率，并且不能检测恩替卡韦耐药突变位点。本专利技术拟检测 rtV173L、 rtL180M、 rtA181V 、 rtA181S 、 rtT184G、 rtS2021、 rtM204V/1、 rtl233V、 rtN236T 和rtM250V等几乎涵盖目前已知所有能引起核苷类似物药物耐受性核苷酸变异位点，并且能 较准确的检测出野生型和耐药突变型混合感染，劣势型在混合群体中占10%即可检出；设计 出一种能在短时间内系统、全面的检测和分析乙型肝炎病毒核苷类似物耐药相关突变检测试 剂盒。目前耐药突变的检测方法主要有以下几种质谱分析，荧光偏振，PCR-肽核酸，限制性 片段长度多态方法RFLP，线性探针分析法，荧光定量PCR熔解曲线分析法和基因芯片技术。 然而，这些方法大多成本昂贵，操作繁琐，不利于广大基层医院开展。因此，本专利技术人在前 期的研究成果的基础上(CN200410052531.1)，结合半自动的结果判读系统，建立一种能够在 短时间内检测和分析乙型肝炎病毒多种核苷类似物药物耐受突变基因型的试剂盒。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种乙型肝炎病毒核苷类似物耐药相关突变检测试剂盒，特别是涉 及使用DNA反向斑点杂交技术，快速准确地区分临床血液样品中野生型和(或)核苷类似物耐 药相关突变型乙型肝炎病毒的检测试剂盒。试剂盒的检测步骤如下(1)提供待检标本并从中提取DNA; (2)使用合成的特定寡核 苷酸引物，利用聚合酶链反应技术扩增包含目的基序的一段耙DNA序列；(3)使被标记的靶 DNA序列与特异性寡核苷酸探针杂交；(4)杂交膜条经显色后，扫描结果并用软件分析并判 断乙型肝炎病毒耐药突变的存在及其相对量。为了达到上述检测步骤，本专利技术提供的乙型肝炎病毒核苷类似物耐药相关突变检测试剂 盒的组分，包括(1)提取样本核酸的核酸抽提试剂；(2)聚合酶链反应试剂，阴、阳质控 品；(3)用于核酸杂交反应的核酸杂交试剂、杂交膜条，其中聚合酶链反应试剂由正向引物、 生物素标记的反向引物、脱氧尿嘧啶核苷三磷酸(dUTP)的脱氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)、 耐热Taq酶和尿嘧啶-DNA-糖基化酶(UDG酶)组成，其特征在于正向引物和生物素标记的反向引物的序列分别是(1) 5'-TAGACTCGTGGTGGACTTCTCTCARTTT-3， (SEQIDNO: 1)(2) 5'-TGGATGTRTCTGCGGCGTTT-3' (SEQIDNO: 2)(3) 生物素-5，-GCCTTRTAAGTTGGCGAG-3， (SEQIDNO: 3)(4) 5'-CGACGTGCAGAGGTGAAGCGAAGTGCA陽3， (SEQIDNO: 4)。 根据本专利技术的一个优选实施方案，所述引物为SEQIDNO: 1 4中15 28bp碱基范围内所有可能的碱基长度和位置组合。根据本专利技术的一个优选实施方案，杂交膜条中用于核酸杂交的5'端氨基标记的寡核苷酸 探针的序列分别是(5 )丽2-5 ，-TWCCTATGGGAGTGGGCCTCAGYCCG-3 ，(SEQ ID NO: 5)(6) NH2-5，-GYCCGTTTCTCYTGGCTCAGTTTACT-3，(SEQIDNO: 6)(7) NH2-5，-CGTTTCTCHTGGCTCAGTTTACTWGY-3，(SEQIDNO: 7) (8 ) NH2-5 ，隱TGGCTCAGTTTACTWGYGCMATTTGT-3 ， (SEQ ID NO: 8) (9 ) NH2-5 ， -GYYTGGCTTTYAGTTATATKGATGAY-3 ， (SEQ ID NO: 9)(10)NH2-5，.-GCTTTYAGYTATATGGATGATSTGGT-3' (SEQ ID NO:10)(11)NH2-5,-TRTCTBTGGGYATMCATTTRAAYMCY-3，(SEQ ID NO:11)(12)NH2-5，.陽TWCCTATGGGATTGGGCCTCAGYCCG陽3，(SEQ ID NO::12)(13)NH2-5，-GYCCGTTTCTCYTGGCTCAGTTTACT-3' (SEQ ID NO:13)(14)NH2-5，-CGTTTCTCHTGACTCAGTTTACTWGY-3'本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种乙型肝炎病毒核苷类似物耐药相关突变检测试剂盒，该试剂盒包括提取样本核酸的核酸抽提试剂，聚合酶链反应试剂，阴、阳质控品，用于核酸杂交反应的核酸杂交试剂、杂交膜条，其中聚合酶链反应试剂由正向引物、生物素标记的反向引物、含脱氧尿嘧啶核苷三磷酸的脱氧核糖核苷三磷酸、耐热Ｔａｑ酶和尿嘧啶－ＤＮＡ－糖基化酶组成，其特征在于正向引物和生物素标记的反向引物的序列分别是： １）５’－ＴＡＧＡＣＴＣＧＴＧＧＴＧＧＡＣＴＴＣＴＣＴＣＡＲＴＴＴ－３’ ２）５’－ＴＧＧＡＴＧＴＲＴＣＴ ＧＣＧＧＣＧＴＴＴ－３’ ３）生物素－５’－ＧＣＣＴＴＲＴＡＡＧＴＴＧＧＣＧＡＧ－３’ ４）５’－ＣＧＡＣＧＴＧＣＡＧＡＧＧＴＧＡＡＧＣＧＡＡＧＴＧＣＡ－３’ 引物序列为１５～２８ｂｐ碱基范围内所有可能的碱基长度和位置组合 。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张太松，董瑞华，陈娟，李明，周新宇，何蕴韶，
申请(专利权)人：中山大学达安基因股份有限公司，
类型：发明
国别省市：81[中国|广州]
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