用于从混合物富集突变核酸的化合物和方法技术

由于非常过量的野生型DNA的同时存在，从生物样品检测罕见体细胞突变的存在经常是挑战性的。本发明专利技术描述了通过排除可扩增的野生型DNA而允许富集突变体DNA的新化合物和方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及核酸化学和核酸扩增的领域。具体地，本专利技术涉及使用可以检测核酸 中的碱基对错配的化合物和方法富集低丰度突变靶核酸。
技术介绍
已知大多数人遗传疾病和癌症由核基因中的突变造成。一般而言，认为突变是遗 传基因座处的特定多态变体。所述突变可以是单个核苷酸差异，经常被称作点突变。在细 胞和组织水平，在特定遗传基因座处的多态性可以导致显著改变的细胞行为。但是，因为即 使相对较小的细胞或组织样品可以含有数百万或数十亿含有该特定遗传基因座的DNA分 子，在遗传基因座处的多态变体的范围和频率的表示需要检测潜在地以非常低频率存在的 等位基因。在大多数情况下，由于非常过量的野生型DNA的同时存在，来自生物样品的罕见 突变的存在的检测提出了巨大的挑战。 因此，本领域中需要选择性地和准确地富集低拷贝突变体DNA的方法，使得它们 的存在在执行扩增反应(诸如PCR)以后可以是可检测的。
技术实现思路
本专利技术涉及用于富集样品中的低丰度等位基因（例如突变体DNA)的方法和组合 物，所述样品允许随后检测这样的等位基因。在第一方面，本专利技术涉及从样品富集核酸混合 物中的靶核酸序列变体的方法，所述靶核酸以两种变体序列的形式存在，其中所述变体在 单个核苷酸位置处不同，所述方法包括，提供包括所述靶核酸序列的样品，其中所述要富集 的变体在大量过量的其它变体中以低丰度存在于所述样品中；提供与所述靶核酸序列的一 条链互补的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸在所述单个核苷酸位置处具有与要富集的变体的 错配且在所述单个核苷酸位置处与所述其它变体完美匹配；提供适合于所述寡核苷酸与所 述靶核酸杂交的条件，以产生由所述寡核苷酸和所述靶核酸序列的任一种变体的一条链组 成的双链体多核苷酸；使所述双链体多核苷酸与连接至亲和标记物的错配嵌入化合物接触 以产生反应混合物，其中所述错配嵌入化合物能够结合所述含有错配的双链体多核苷酸且 不能结合所述不含有错配的双链体多核苷酸；使所述反应混合物经历亲和基质，所述亲和 基质识别和结合所述错配嵌入化合物上的亲和标记物；洗涤所述反应混合物和使所述亲和 基质与未结合所述亲和基质的所有材料分离；和提供缓冲液以从所述亲和基质洗脱核酸， 和收集洗脱的含有富集的靶核酸序列变体的缓冲液。 在第二方面，本专利技术涉及从样品检测核酸混合物中的靶核酸序列的突变体等位基 因的方法，其中所述突变体等位基因在单个核苷酸位置处与野生型等位基因不同且在大量 过量的野生型等位基因中以低丰度存在于所述样品中，所述方法包括，富集所述样品中的 突变体等位基因，其中所述富集如下进行：提供与所述靶核酸序列的一条链互补的寡核苷 酸，其中所述寡核苷酸在所述单个核苷酸位置处具有与所述突变体等位基因的错配且在所 述单个核苷酸位置处与所述野生型等位基因完美匹配；提供适合于所述寡核苷酸与所述靶 核酸杂交的条件，以产生由所述寡核苷酸以及所述突变体等位基因或所述野生型等位基因 的一条链组成的双链体多核苷酸；使所述双链体多核苷酸与连接至亲和标记物的错配嵌入 化合物接触以产生反应混合物，其中所述错配嵌入化合物能够结合所述含有错配的双链体 多核苷酸且不能结合所述不含有错配的双链体多核苷酸；使所述反应混合物经历亲和基 质，所述亲和基质识别和结合所述错配嵌入化合物上的亲和标记物；洗涤所述反应混合物 和使所述亲和基质与未结合所述亲和基质的所有材料分离；和提供缓冲液以从所述亲和基 质洗脱核酸，和收集洗脱的含有富集的突变体等位基因的缓冲液；扩增所述富集的突变体 等位基因；和检测富集的扩增的突变体等位基因的产物或从所述富集的扩增的突变体等位 基因产生的信号。 在第三方面，本专利技术涉及从样品富集核酸混合物中的靶核酸序列变体的方法，所 述靶核酸以两种变体序列的形式存在，其中所述变体在单个核苷酸位置处不同，所述方法 包括：提供包括所述靶核酸序列的样品，其中所述要富集的变体在大量过量的其它变体中 以低丰度存在于所述样品中；加热所述样品，使得核酸的混合物变性；提供适合于所述靶 核酸的重退火的条件，其中可以在一种变体序列的一条链和其它变体序列的一条链之间形 成双链体多核苷酸，以在所述变体存在差异的单个核苷酸位置处产生错配；使所述双链体 多核苷酸与连接至亲和标记物的错配嵌入化合物接触以产生反应混合物，其中所述错配嵌 入化合物能够结合所述含有错配的双链体多核苷酸且不能结合所述不含有错配的双链体 多核苷酸；使所述反应混合物经历亲和基质，所述亲和基质识别和结合所述错配嵌入化合 物上的亲和标记物；洗涤所述反应混合物和使所述亲和基质与未结合所述亲和基质的所有 材料分离；和提供缓冲液以从所述亲和基质洗脱核酸，和收集洗脱的含有富集的靶核酸序 列变体的缓冲液。 在第四方面，本专利技术涉及从样品检测核酸混合物中的靶核酸序列的突变体等位基 因的方法，其中所述突变体等位基因在单个核苷酸位置处与野生型等位基因不同且在大量 过量的野生型等位基因中以低丰度存在于所述样品中，所述方法包括：富集所述样品中的 突变体等位基因，其中所述富集如下进行：加热所述样品，使得核酸的混合物变性；提供适 合于所述靶核酸的重退火的条件，其中可以在所述突变体等位基因的一条链和所述野生型 等位基因的一条链之间形成双链体多核苷酸，以在所述等位基因存在差异的单个核苷酸位 置处产生错配；使所述双链体多核苷酸与连接至亲和标记物的错配嵌入化合物接触以产生 反应混合物，其中所述错配嵌入化合物能够结合所述含有错配的双链体多核苷酸且不能结 合所述不含有错配的双链体多核苷酸；使所述反应混合物经历亲和基质，所述亲和基质识 别和结合所述错配嵌入化合物上的亲和标记物；洗涤所述反应混合物和使所述亲和基质与 未结合所述亲和基质的所有材料分离；和提供缓冲液以从所述亲和基质洗脱核酸，和收集 洗脱的含有富集的靶核酸序列变体的缓冲液；扩增所述富集的突变体等位基因；和检测富 集的扩增的突变体等位基因的产物或从所述富集的扩增的突变体等位基因产生的信号。 在第五方面，本专利技术涉及用于富集罕见等位基因DNA的化合物，其中所述化合物 是图2的化合物。【附图说明】 图1显示了基于铭的嵌入剂肋〇^)2((：11巧8；〇3+(左）和1?11〇^) 2(口1^；〇3+(右） 的结构。 图2显示了本专利技术的生物素结合的铑嵌入剂Rh(bpy)2(phzi) (PEG3-生物素）3+的 结构。 图3显示了肋〇^5〇2(口1^;〇3+和1?11〇^5〇2(口112；[-(1) 21{)3+对就人￡6?1?基因中的 T790M突变位点而言完美匹配的突变双链体（M-PM)和C:A错配双链体的切割效率的UPLC 分析。 图 4 是 Rh (bpy) 2 (phzi_C02H)3+ 撕基人 Rh (bpy) 2 (phzi)3+ 撕你 Rh(bpy)2(phzi) (PEG3-生物素）3+ (热必io"随着紫外光照射时间而变化的切割效率的图 解表示。 图5是随着每种铭螯合剂的浓度而变化的、Rh(bpy)2(phzi) 3+撕你3片〇/?人>在30 分钟紫外光照射以后、和Rh (bpy) 2 (phzi) (PEG3-生物素）3+ (热必io"在30分钟或60分钟 紫外光照射以后的切割效率的图解表示。 图6显示了参与 (本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种从样品富集核酸混合物中的靶核酸序列变体的方法，所述靶核酸以两种变体序列的形式存在，其中所述变体在单个核苷酸位置处不同，所述方法包括：提供包括所述靶核酸序列的样品，其中所述要富集的变体在大量过量的其它变体中以低丰度存在于所述样品中；提供与所述靶核酸序列的一条链互补的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸在所述单个核苷酸位置处具有与要富集的变体的错配且在所述单个核苷酸位置处与所述其它变体完美匹配；提供适合于所述寡核苷酸与所述靶核酸杂交的条件，以产生由所述寡核苷酸和所述靶核酸序列的任一种变体的一条链组成的双链体多核苷酸；使所述双链体多核苷酸与连接至亲和标记物的错配嵌入化合物接触以产生反应混合物，其中所述错配嵌入化合物能够结合所述含有错配的双链体多核苷酸且不能结合所述不含有错配的双链体多核苷酸；使所述反应混合物经历亲和基质，所述亲和基质识别和结合所述错配嵌入化合物上的亲和标记物；洗涤所述反应混合物和使所述亲和基质与未结合所述亲和基质的所有材料分离；和提供缓冲液以从所述亲和基质洗脱核酸，和收集洗脱的含有富集的靶核酸序列变体的缓冲液。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：A古普塔，N舍恩布伦纳，
申请(专利权)人：霍夫曼拉罗奇有限公司，
类型：发明
国别省市：瑞士;CH