本发明专利技术公开了一种乙型肝炎病毒核苷类似物耐药突变检测试剂盒，包括：(1)一个基因芯片，其上带有：①抗乙肝病毒核苷类似物14个突变类型的探针以及8个正常对照探针，探针选自SEQID?Nos：1-43；②标记有生物素点的DNA序列，序列为SEQ?IDNo.44；③带有编码β-球蛋白部分的DNA序列，作为内控点，序列为SEQ?ID?Nos.45-46；(2)引物，DNA序列选自SED?IDNos.47-48。本发明专利技术试剂盒提供了检测4种抗乙肝药物常见的14个耐药突变位点的平台，检测突变点较多，操作方便，结果准确可靠，对于慢性HBV感染抗病毒治疗中耐药性的确定和监测具有重要的意义。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因领域，具体是一种乙型肝炎病毒(HBV)核苷类似物耐药突变检测试齐U盒。
技术介绍
慢性乙型肝炎是一种严重危害健康、威胁生命的进展性疾病。我国约有1. 2亿人携带乙肝病毒，其中慢性乙肝患者约3000万例，每年约有35万人死于慢性乙肝相关疾病。 在目前的医学条件下，一旦乙肝病毒感染慢性化，就很难将之从体内彻底清除。近年来，国内外权威的治疗指南都指出，慢性乙型肝炎的治疗目标是长期抑制病毒，延缓疾病进展。越来越多的专家已经认识到，长期的核苷类似物治疗是一个现实的治疗方案，能够帮助患者实现上述治疗目标。然而，过去由于只有拉咪呋定一种口服抗病毒药物应用于临床，治疗的选择受到限制，并因YMDD变异等相关耐药问题受到临床医生的关注。 随着阿德福韦酯、恩替卡韦的上市及逐步应用，特别是2006年10月我国《乙肝防治指南》的发布，抗病毒治疗在乙型肝炎治疗中的作用得到极大的重视，而核苷类似物由于其疗效确切、副作用较少、安全可靠、服药方便而在抗病毒治疗中得到越来越普遍的应用。但是，对药物产生耐药性是长期抗病毒治疗过程中不可避免的重要问题。据文献报道，拉咪呋定初治慢性乙型肝炎1年至5年的耐药发生率分别为^^^42%,53^^70%和70% ；阿德福韦酯初治患者ι年至5年的耐药发生率分别So^d^ui^us^^n^1^;恩替卡韦的耐药率发生较低，其初治患者1年至3年的耐药发生率分别为0%、0^^Π< 1%，且往往需在YMDD 变异的基础上才出现。一旦产生耐药性变异，往往会发生病毒学的反弹和临床表现的恶化， 需要及时调整和更换治疗方案。可以看出，耐药性的发生随着治疗时间的延长而增高，且不少药物之间还存在着交叉耐药性，因此，及时检测并发现耐药性变异的发生，可以有效的评估治疗效果，进一步指导治疗药物的选择，具有重要的临床意义。目前使用的方法主要检测基因型耐药，包括直接测序、聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)、序列特异性PCR、线性探针杂交技术及基因芯片等，但对各种方法的准确度作对比与评价的报道不多。其中，基因序列测定是最直接的方法，但过程复杂，成本高。序列特异性PCR特异性不够，临床已基本不用。PCR-RFLP方法是一种简明和较为完善的方法，以错配PCR结合限制性片段长度多态性方法，快速检测患者体内YMDD变异株的发生情况，该方法通过错配PCR引入独特的酶切位点，再用酶切分析，图谱简单，容易判断。此方法具有较好的可靠性和可行性。由于酶切方法只能检测单点突变，对于可能伴随其它变异需经过测序分析，因此实际应用中应结合PCR-RFLP筛检和PCR产物克隆后测序互相证实和补充。线性探针杂交技术(LiPA)除了能够对HBV进行基因分型外，能够同时检测耐药株和野生株，结果相对准确，但由于其寡核苷酸探针必须是针对已知的突变位点，一个变异位点可能需要多个探针，无法测得未知变异，得到的信息有限，且价格昂贵。而基因芯片是将寡核苷酸片段作为探针有序及高(或低)密度地固定于基质载体上，与待测的用荧光(或生物素)标记的待测核酸按照碱基配对的原则进行杂交，经相关检测设备进行结果分析。作为一种高通量的DNA分析技术，可以对众多疾病相关基因、耐药分型及多种疾病病种进行并行的高时效分析，国内外均有应用于YMDD变异检测的成功报道， 特别适用于高通量信息的筛查，是今后发展的一个重点方向。在以上各种检测方法中，直接测序法因其原理简单，重复性好，可以同时检测多个位点的突变，是目前在临床上应用最多的一种方法，已经有商业化的试剂盒销售，也可以在各实验室自行完成，但操作步骤多，检测周期长，费用较高，需要有一定经验的专业人员操作，对病毒载量有一定的要求；而基因芯片作为一种高通量的DNA分析技术，可以对众多疾病相关基因、耐药分型及多种疾病病种进行并行的高时效分析，是一种信息全面、功能强大的基因分析技术。国内已有应用基因芯片检测拉咪呋定相关的YMDD变异，但能同时检测阿德福韦酯、恩替卡韦等多种核苷类似物相关的耐药性变异未见报道，且往往需要对样本核酸进行PCR扩增，国内亦无相关产品。有关HBV耐药性检测的试剂仍由国外产品主导，且普遍价格昂贵，操作复杂，在国内尚无普遍应用，无法适应我国当前对乙肝病毒耐药性检测的实际需求，而国产商业化的检测试剂仍是空白，因此急需开发出一种操作简便，价格低廉，可以进行快速、准确、高通量检查的检测试剂和仪器。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种具有相近的Tm值，涵盖检测4种乙肝抗病毒核酸类似物 (拉米夫定、阿德福韦酯、恩替卡韦、替比夫定)最常见突变位点(共14个)的乙型肝炎病毒核苷类似物耐药突变检测试剂盒。本专利技术的乙型肝炎病毒核苷类似物耐药突变检测试剂盒，包括(1) 一个基因芯片，其上带有①抗乙肝病毒核苷类似物14个突变类型的探针以及8个正常对照探针，探针选自 SEQ ID Nos 1-43 ；②标记有生物素点的DNA序列(Bio)，用于监控杂交是否成功，序列为SEQ ID No. 44 ；③带有编码β-球蛋白部分的DNA序列(IC)，作为内控点，用于监控PCR体系是否成功，序列为 SEQ ID Nos. 45-46 ；(2)引物，用于扩增乙肝病毒基因组中横跨P区(DNA聚合酶逆转录酶区)的一段高保守序列引物，DNA序列选自SED ID Nos. 47-48。具体序列如下权利要求1.一种乙型肝炎病毒核苷类似物耐药突变检测试剂盒，包括(1)一个基因芯片，其上带有①抗乙肝病毒核苷类似物14个突变类型的探针以及8个正常对照探针，探针选自SEQ ID Nos 1-43 ；②标记有生物素点的DNA序列，序列为SEQID No. 44 ；③带有编码β-球蛋白部分的DNA序列，作为内控点，序列为SEQID Nos. 45-46 ；(2)引物，DNA序列选自SED ID Nos. 4了_48。2.权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述探针5'或3'端经过胺基化处理。3.权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述基因芯片包括用于定位探针的位置标记。4.权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述基因芯片的探针是固定在尼龙膜上。5.权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述引物的5'端标记有生物素。全文摘要本专利技术公开了一种乙型肝炎病毒核苷类似物耐药突变检测试剂盒，包括(1)一个基因芯片，其上带有①抗乙肝病毒核苷类似物14个突变类型的探针以及8个正常对照探针，探针选自SEQID Nos1-43；②标记有生物素点的DNA序列，序列为SEQ IDNo.44；③带有编码β-球蛋白部分的DNA序列，作为内控点，序列为SEQ ID Nos.45-46；(2)引物，DNA序列选自SED IDNos.47-48。本专利技术试剂盒提供了检测4种抗乙肝药物常见的14个耐药突变位点的平台，检测突变点较多，操作方便，结果准确可靠，对于慢性HBV感染抗病毒治疗中耐药性的确定和监测具有重要的意义。文档编号C12Q1/70GK102286635SQ20111020290公开日2011年12月21日 申请日期2011年7月15日 优先权日2011年7月15日专利技术者朱娟娟 申请人:广东凯普生物科技股份有限公司本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种乙型肝炎病毒核苷类似物耐药突变检测试剂盒，包括：（１）一个基因芯片，其上带有：①抗乙肝病毒核苷类似物１４个突变类型的探针以及８个正常对照探针，探针选自ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏｓ：１－４３；②标记有生物素点的ＤＮＡ序列，序列为ＳＥＱ ＩＤＮｏ．４４；③带有编码β－球蛋白部分的ＤＮＡ序列，作为内控点，序列为ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏｓ．４５－４６；（２）引物，ＤＮＡ序列选自ＳＥＤ ＩＤ Ｎｏｓ．４７－４８。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：朱娟娟，
申请(专利权)人：广东凯普生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：44
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