本发明专利技术公开了一种小鼠nNOS基因在抗干旱和抗盐转基因水稻中的应用，属于水稻遗传转化技术领域。小鼠nNOS基因的CDS序列如SEQ ID NO.2所示，其编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。通过将小鼠nNOS基因导入到水稻中即可提高水稻的干旱和盐胁迫耐受性。本发明专利技术利用小鼠nNOS基因转化，获得的转基因植株对多种非生物胁迫（干旱和高盐）具有抗性，实现了一个基因提高多种抗性。本发明专利技术为植物抗逆基因工程提供了重要的基因资源，以为实施绿色农业提供新的遗传资源。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于水稻遗传转化
，具体涉及一种小鼠nNOS基因在抗干旱和抗盐转基因水稻中的应用。
技术介绍
一氧化氮是一种重要的气体分子，在植物生长发育和环境适应的各个阶段都发挥了重要作用。很多研究利用NO的外源释放剂提高植物的NO含量或者利用NO的清除剂降低植物体内的NO含量，证明了NO在植物的生长发育如根的发育，开花，衰老以及逆境胁迫如生物胁迫，非生物胁迫如干旱、盐、冷以及重金属胁迫过程中起到了非常重要的调控作用。NO在环境胁迫和生长中的广泛作用暗示其在基因工程的遗传育种培养高抗高产的作物品种可能具有重要的应用价值。目前，高等植物中的NO合成酶尚未发现，利用转基因技术将哺乳动物中小鼠的神经元NO合成酶基因nNOS转化到植物中将可以获得内源NOS活性提高、NO含量提高的转基因植株，对于NO的功能研究以及遗传育种都具有重要意义。干旱和盐胁迫是导致作物减产甚至绝产的两个重要环境因素，全世界每年因为干旱和盐胁迫导致的粮食减产产生的经济损失达到几百亿美元，水稻是亚洲尤其是中国最重要的粮食作物，因此培育优良的具有抗干旱和盐胁迫的水稻品种具有重要的意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种小鼠nNOS基因在抗干旱和抗盐转基因水稻中的应用。本专利技术为NO在水稻中的研究提供新的材料，为实施绿色农业提供新的遗传资源。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一种培育耐干旱和盐胁迫的植物的方法，包括以下步骤：(1)构建小鼠nNOS蛋白的植物转化过表达载体；(2)将所述载体导入到所需培育的植物中。所述的小鼠nNOS蛋白优选为如下(1)或(2)：(1)由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列所组成的蛋白；(2)将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸的取代或添加或缺失且与植物耐干旱和盐胁迫相关的由SEQ ID NO.1衍生的蛋白质。所述的小鼠nNOS蛋白编码的基因优选为如下(1)或(2)或(3)的DNA分子：(1)SEQ ID NO.2所示的DNA分子；(2)在严格条件下与(1)限定的DNA序列杂交且编码耐受干旱和盐胁迫相关蛋白的
DNA分子；(3)与(1)限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码耐受干旱和盐胁迫相关蛋白的DNA分子。所述的植物优选为水稻。一种小鼠nNOS蛋白或其编码基因在培育耐干旱和盐胁迫的水稻中的应用。一种NO合成酶或其编码基因在培育耐干旱和盐胁迫的水稻中的应用。一种NO合成酶或其编码基因在培育耐干旱和盐胁迫的植物中的应用。一种NO合成酶或其编码基因在植物育种中的应用。本专利技术通过将小鼠中的神经元一氧化氮合成酶基因nNOS导入到水稻中，获得新的抗旱、抗盐能力明显提高的转基因水稻。本专利技术利用该基因转化，获得的转基因植株对多种非生物胁迫(干旱和高盐)具有抗性，从而实现一个基因提高多种抗性。本专利技术为植物抗逆基因工程提供了重要的基因资源，以为实施绿色农业提供新的遗传资源。附图说明图1是nNOS基因转化水稻再生植株的PCR鉴定示意图。图中所用Marker为天根DNA MarkerⅢ，对应最亮条带为1.2kb；1-31为阳性株系扩增片段大小约为750bp；WT为野生型中花11。图2是T3代3个阳性转基因植株中nNOS基因半定量PCR结果图。图3是nNOS转基因水稻与野生型(WT)植株NOS酶活测定结果图。图4是nNOS转基因水稻与野生型植株叶片中NO DAF-FM DA染色图。图5是nNOS转基因水稻与野生型植株叶片中NO DAF-FM DA染色统计结果图。图6是自由基测定的nNOS转基因水稻与野生型NO含量的结果图。图7是nNOS转基因水稻和野生型幼苗在含有200mM甘露醇以及正常(对照)的1/2MS培养基上生长10天的状况图。图8是nNOS转基因水稻和野生型幼苗在含有200mM NaCl以及正常的1/2MS培养基上生长10天的状况图。图9是nNOS转基因水稻和野生型幼苗在含有200mM甘露醇或200mM NaCl以及正常的1/2MS培养基上生长10天的相对鲜重的统计结果图。图10是nNOS转基因水稻和野生型幼苗在含有200mM甘露醇或200mM NaCl以及正常的1/2MS培养基上生长10天的相对株高的统计结果图。图11是水稻转基因植株和野生型控水(干旱处理)14天、复水7天后的表型图。图12是水稻转基因植株和野生型控水14天、复水7天后存活率的统计结果图。图13是nNOS转基因水稻T3代三个株系和野生型离体叶片失水率的统计结果图。图14是nNOS转基因水稻T3代三个株系和野生型在干旱和高盐处理后2天前后相对电导率的检测结果，处理前为对照。图15是nNOS转基因水稻T3代三个株系和野生型在干旱和高盐处理2天前后MDA含量统计结果图，处理前为对照。具体实施方式下面结合具体实施对本专利技术做出详细的描述。下述实施例中的具体实施方式中没有特别说明的实验方法，均为常规实验方法。下述实施例中的实验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂公司购得。以下实施例中的定量实验，均为三次重复实验平均结果。实施例1nNOS基因分离克隆构建有nNOS基因CDS序列全长的nNOSPCW质粒(Roman,L.J.,Sheta,E.A.,Martasek,P.,Gross,S.S.,Liu,Q.and Masters,B.S.S.(1995)High-level expression of functional rat neuronal nitric oxide synthase in Escherichia coli.Proc.Natl Acad.Sci.USA92:8428–8432.)，通过NdeI、XbaI双酶切将nNOS基因CDS全长剪切下来。nNOS基因CDS全长的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，nNOS的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。其中，双酶切体系100μL：PCW质粒85μL，10×buffer 10μL，NdeI、XbaI限制性内切酶各2.5μL。37℃水浴锅酶切30min后琼脂糖凝胶电泳，用凝胶回收试剂盒(购自Omega公司，美国)回收特异带约4.4kb的nNOS DNA片段(提取步骤参照使用说明)。实施例2植物转化超表达载体构建将实施例1回收纯化的nNOS DNA片段用DNA Polymerase I(Klenow NEB)补平，然后连入SmaI酶切去磷酸化处理的PUbiO载体。连接转化大肠杆菌DH5感受态细胞，菌落PCR鉴定得到正向阳性克隆，测序验证为正确的nNOS基因序列，没有移码，即Pubio-nNOS重组载体构建成功。将重组载体Pubio-nNOS转到农杆菌EHA105中并保存菌株。PUbiO载体的构建：利用HindIII和EcoRI，将pAHC17载体上的玉米泛素启动子的区间酶切下来，连接到同样用HindIII和EcoRI双酶切的载体pCAMBIA1301上，形成了可转化水稻的过表达载体PUbiO。实施例3nNOS转基因水稻的获得1、农杆菌菌液的制备将转有重组载体Pubio-nNOS的农杆菌在含有卡那霉素+庆大霉素的固体LB培养基上划
线，28℃暗培养两天。挑取单菌落接种在新的加有卡那霉素的LB平板上，28℃暗培养2-3天；用分光光度计测量菌液的本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种培育耐干旱和盐胁迫的植物的方法，其特征在于包括以下步骤：（1）构建小鼠nNOS蛋白的植物转化过表达载体；（2）将所述载体导入到所需培育的植物中。
【技术特征摘要】
1.一种培育耐干旱和盐胁迫的植物的方法，其特征在于包括以下步骤：（1）构建小鼠nNOS蛋白的植物转化过表达载体；（2）将所述载体导入到所需培育的植物中。2.根据权利要求1所述的培育耐干旱和盐胁迫的植物的方法，其特征在于：所述的小鼠nNOS蛋白是如下（1）或（2）：（1）由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列所组成的蛋白；（2）将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸的取代或添加或缺失且与植物耐干旱和盐胁迫相关的由SEQ ID NO.1衍生的蛋白质。3.根据权利要求2所述的培育耐干旱和盐胁迫的植物的方法，其特征在于：所述的小鼠nNOS蛋白编码的基因为如下（1）或（2）或（3）的DNA分子：（1）SEQ ID NO.2所示的DNA分子；（2）在严格条件下与（1）限定的DNA序列杂交且编码耐受干旱和盐胁迫相关蛋白的DNA分子；（3）与（1）限定的DNA序列具有90%以上同源性且编码耐受干旱和盐胁迫相关蛋白的DNA分子。4.根据权利要求1所述的培育耐干旱和盐胁迫的植物的方法，其特征在于：所述的植物为水稻。5.根据权利要求4所述的培育耐干旱和盐胁迫的植物的方法，其特征在于（1）包括如下步骤：1）构建有nNOS基因CDS序列全长的nNOSPCW质粒，通过NdeI、XbaI双酶切将nNOS基因CDS全长剪切下来，通过琼脂糖凝胶电泳回收nNOS DNA片段；2）回收纯化的nNOS DNA片段用DNA PolymeraseI补平，然后连入SmaI酶切去磷酸化处理的PUbiO载体，筛选nNOS DNA片段正向连接到PUbiO载体上的重组载体Pubio-nNOS，将重组载体Pubio-nNOS转到农杆菌EHA105中并保存菌株；所述的PUbiO载体的构建包括如下步骤：利用HindIII 和 EcoRI，将pAHC17载体上的玉米泛素启动子的区间酶切下来，连接到同样用HindIII 和 EcoRI双酶切的载体pCAMB...
【专利技术属性】
技术研发人员：吕应堂，蔡维，
申请(专利权)人：武汉大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42
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