一种建立农杆菌介导灯盏花高效转染体系的方法技术

本发明专利技术公开了一种建立农杆菌介导灯盏花高效转染体系的方法，所述方法包括以下步骤：侵染和共培养阶段：将灯盏花愈伤组织切成块状放入三角瓶中，加入菌液，瓶口密封，真空条件下侵染，侵染后倒去菌液，将叶片晾干，转接到共培养培养基中进行暗培养；恢复培养阶段；筛选培养阶段；分化培养阶段：生根阶段：将抗性芽转接到生根培养基培养，得到完整的抗性苗；阳性苗检测阶段。本发明专利技术通过探索、优化灯盏花愈伤组织再生途径建立灯盏花高效的愈伤组织再生体系，愈伤组织形成频率为90％以上，愈伤组织分化率在90％以上，转化效率高达25％以上，可以满足灯盏花育种需求，适合大规模工业生产和商业育种。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于农杆菌介导
，尤其涉及一种建立农杆菌介导灯盏花高效转染体系的方法。
技术介绍
灯盏花，学名为短葶飞蓬(Erigeron breviscapus)，菊科飞蓬属，一般生长于海拔1,200米至3,500米的地区，多生长于草地、亚高山开旷山坡、中山和林缘。分布于我国的西南地区，尤以云南最多。由于灯盏花适应性强，自然繁殖力高，野生资源有较大分布，其中文山州、红河州分布较广。灯盏花作为云南特有的野生天然药用植物，它的医药价值很高，全株可入药。其具有散寒解表，祛风除湿，活络止痛，扩张血管，改善脑血循环等作用，临床上常用灯盏花的口服或静脉滴注制剂来治疗或辅助治疗冠心病，心绞痛等心脑血管疾病。目前灯盏花被认为是治疗闭塞性脑血管疾病和脑溢血后遗症最为有效的天然药物,有效率达95％以上,灯盏花已成为全国中医院急诊必备中成药,被列为国家中药保护品种。灯盏花现存的野生数量有限，并且常见品种单株灯盏乙素含量较低，而我国人工栽培灯盏花仅有10余年的历史，现有栽培种都是短期驯化得到，各种抗性都较差，而由于灯盏花在心脑血管疾病方面的显著疗效就使它的市场需求量大增，现在每年对于灯盏花的需求量达到了一万吨以上并且还在增长，已经远超出了现有的灯盏花产量。因此，培育高产、有效成分含量高、抗逆、抗病等的优良灯盏花品种是现在亟需解决的问题。而目前转基因技术由于其周期短、针对性强、极大扩宽可用的基因资源等显著优势被广泛运用于各种作物的育种。但是国内目前从事灯盏花相关研究的较少并且大部分还停留在化学成分的研究上，极少从事灯盏花转基因相关研究的，而且采用的基因枪的方法来进行灯盏花转基因。众所周知，基因枪法存在诸如插入位点不确定、遗传稳定性差等较大弊端。
技术实现思路
针对现有技术灯盏花遗传转化研究少转化技术不成熟等问题，本专利技术提供一种建立农杆菌介导灯盏花高效转染体系的方法。本专利技术使用农杆菌介导灯盏花转化，打通农杆菌介导灯盏花高效转染体系。这是通过农杆菌转染体系培育新型灯盏花最为重要的一步，同时也是得灯盏花基因功能研究的重要技术手段。建立灯盏花农杆菌介导高效转染体系意味着能够突破灯盏花自身遗传屏障，获得难以通过传统育种方式生产的新品种。本专利技术的技术方案如下：一种建立农杆菌介导灯盏花高效转染体系的方法，所述方法包括以下步骤：侵染和共培养阶段：将灯盏花愈伤组织切成块状放入三角瓶中，加入菌液，瓶口密封，真空条件下侵染，侵染后倒去菌液，将叶片晾干，转接到共培养培养基中进行共培养；侵染时真空度为0.01～0.1MPa，侵染时间为0.5～2h；侵染时间过短，农杆菌与灯盏花组织接触时间短，侵染效果不好；侵染时间过长，造成被侵染细胞死亡以及农杆菌抑制不住。所述共培养为暗培养，培养温度为22～26℃，培养时间为3～7天；所述共培养培养基为MS基础培养基+6-BA 2～5mg·L-1+NAA 1～4mg·L-1+TDZ 0.1～1mg·L-1+蔗糖20～60g·L-1+葡萄糖10～60g·L-1+琼脂8～16g·L-1+AS50～200μmol·L-1，pH 5.2～5.8，118～125℃灭菌20～30min；恢复培养阶段：将共培养后的愈伤组织转接到恢复培养基中进行恢复培养；所述恢复培养基成分如下：MS基础培养基+6-BA 2～5mg·L-1+NAA1～4mg·L-1+TDZ 0.1～1mg·L-1+Cef 250～500mg·L-1+蔗糖20～60g·L-1+琼脂8～16g·L-1，pH5.2～5.8，118～125℃高压灭菌20～30min，恢复培养阶段目的是使愈伤组织在共培养阶段受到农杆菌的损伤得到恢复，同时在培养基中添加Cef抑制愈伤组织上残留的农杆菌生长。恢复培养条件为：22～26℃光照培养，每天光照12～14h，光照强度1500～2500lx，培养1～5天；筛选培养阶段：恢复培养后的愈伤组织转接到筛选培养基中进行筛选培养，获得新增殖愈伤组织；所述筛选培养基成分如下：MS基础培养基+6-BA 2～5mg·L-1+NAA1～4mg·L-1+TDZ 0.1～1mg·L-1+Cef 250～500mg·L-1+Hyg 5～20mg·L-1蔗糖20～60g·L-1+琼脂8～16g·L-1，pH5.2～5.8，118～125℃高压灭菌20～30min；筛选培养条件如下：22～26℃光照培养，每天光照12～14h，光照强度1500～2500lx，培养20～50天；分化培养阶段：将新增殖愈伤组织转接到分化培养基A中，培养至愈伤组织表面形成小芽，然后转至分化培养基B中长成1～3cm的抗性芽，分化培养基A是诱导小芽的形成，分化培养基B是促进小芽快速生长成完整的植株；所述分化培养基A成分如下：SH基础配方+6-BA 0.1～2mg·L-1+NAA0.1～2mg·L-1+Ade 40～150mg·L-1+Glu 5～20mg·L-1+CH 0.5～3g·L-1+Cef50～300mg·L-1+Hyg 3～15mg·L-1+蔗糖20～60g·L-1+琼脂8～16g·L-1，pH 5.2～5.8，118～125℃灭菌20～30min；SH基础配方成分如下：硝酸钾2.5～5.0g·L-1，硫酸镁0.195～0.4g·L-1，磷酸二氢铵0.3～0.6g·L-1，氯化钙151～300mg·L-1，甘氨酸2～4mg·L-1，肌醇100～200mg·L-1，盐酸硫胺素0.4～0.8mg·L-1，盐酸吡哆素0.5～1.0mg·L-1，烟酸0.5～1.0mg·L-1，乙二胺四乙酸铁纳19.8～40mg·L-1，六水氯化钴0.1～0.2mg·L-1，五水硫酸铜0.2～0.4mg·L-1，硼酸5～10mg·L-1，碘化钾1～2mg·L-1，一水硫酸锰10～20mg·L-1，二水钼酸钠0.1～0.2mg·L-1，七水硫酸锌1～2mg·L-1；分化培养基B成分如下：MS基础培养基+KT 0.5～2mgL-1+NAA 0.1～3mgL-1+Cef 50～300mgL-1+Hyg 3～15mgL-1+蔗糖20～60g·L-1+琼脂8～16g·L-1，pH5.2～5.8，118～125℃灭菌20～30min；分化培养条件如下：22～26℃光照培养，每天光照12～14h，光照强度1500～2500lx；生根阶段：将抗性芽转接到生根培养基培养，得到完整的抗性苗；所述生根培养基成分如下：White培养基+IBA 0.01～1mg·L-1+蔗糖20～60g·L-1+琼脂8～16g·L-1+Cef 50～300mgL-1，pH5.2～5.8，118～125℃灭菌20～30min；White培养基成分如下：硝酸钾40～100mgL-1，柠檬酸1.0～2.0mgL-1，硝酸钙200～300mgL-1，硫酸镁600～700mgL-1，硫酸钠50～80mgL-1，氯化钾60～80mgL-1，磷酸二氢钠10～20mgL-1，盐酸硫胺素0.05～1mgL-1，盐酸吡哆素0.05～1mgL-1，盐酸0.1～1mgL-1，甘氨酸2～5mgL-1，硫酸锰5～10mgL-1，硫酸锌2～5mgL-1，碘化钾0.1～1mgL-1；生根培养条件如下：22～28℃光照培养，光照强度为1500～2500lx，每天光照时间12～本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种建立农杆菌介导灯盏花高效转染体系的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：侵染和共培养阶段：将灯盏花愈伤组织切成块状放入三角瓶中，加入菌液，瓶口密封，真空条件下侵染，侵染后倒去菌液，将叶片晾干，转接到共培养培养基中进行共培养；恢复培养阶段：将共培养后的愈伤组织转接到恢复培养基中进行恢复培养；筛选培养阶段：恢复培养后的愈伤组织转接到筛选培养基中进行筛选培养，获得新增殖愈伤组织；分化培养阶段：将新增殖愈伤组织转接到分化培养基A中，培养至愈伤组织表面形成小芽，然后转至分化培养基B中培养长成1～3cm的抗性芽；生根阶段：将抗性芽转接到生根培养基培养，得到完整的抗性苗；阳性苗检测阶段：取抗性苗的叶片，提取DNA，进行PCR扩增，将PCR产物进行凝胶电泳，得到农杆菌成功侵染灯盏花的阳性苗，建立农杆菌介导灯盏花高效转染体系。

【技术特征摘要】
1.一种建立农杆菌介导灯盏花高效转染体系的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：侵染和共培养阶段：将灯盏花愈伤组织切成块状放入三角瓶中，加入菌液，瓶口密封，真空条件下侵染，侵染后倒去菌液，将叶片晾干，转接到共培养培养基中进行共培养；恢复培养阶段：将共培养后的愈伤组织转接到恢复培养基中进行恢复培养；筛选培养阶段：恢复培养后的愈伤组织转接到筛选培养基中进行筛选培养，获得新增殖愈伤组织；分化培养阶段：将新增殖愈伤组织转接到分化培养基A中，培养至愈伤组织表面形成小芽，然后转至分化培养基B中培养长成1～3cm的抗性芽；生根阶段：将抗性芽转接到生根培养基培养，得到完整的抗性苗；阳性苗检测阶段：取抗性苗的叶片，提取DNA，进行PCR扩增，将PCR产物进行凝胶电泳，得到农杆菌成功侵染灯盏花的阳性苗，建立农杆菌介导灯盏花高效转染体系。2.如权利要求1所述的建立农杆菌介导灯盏花高效转染体系的方法，其特征在于，侵染和培养阶段：侵染时真空度为0.01～0.1MPa，侵染时间为0.5～2h；共培养为暗培养，暗培养温度为22～26℃，培养时间为3～7天。3.如权利要求1所述的建立农杆菌介导灯盏花高效转染体系的方法，其特征在于，所述共培养培养基为MS基础培养基+6-BA 2～5mg·L-1+NAA 1～4mg·L-1+TDZ 0.1～1mg·L-1+蔗糖20～60g·L-1+葡萄糖10～60g·L-1+琼脂8～16g·L-1+AS 50～200μmol·L-1，pH 5.2～5.8，118～125℃灭菌20～30min 。4.如权利要求1所述的建立农杆菌介导灯盏花高效转染体系的方法，其特征在于，所述恢复培养基成分如下：MS基础培养基+6-BA2～5mg·L-1+NAA 1～4mg·L-1+TDZ 0.1～1mg·L-1+Cef 250～500mg·L-1+蔗糖20～60g·L-1+琼脂8～16g·L-1，pH5.2～5.8，118～125℃高压灭菌20～30min。恢复培养条件为：22～26℃光照培养，每天光照12～14h，光照强度1500～2500lx，培养1～5天。5.如权利要求1所述的建立农杆菌介导灯盏花高效转染体系的方法，其特征在于，筛选阶段：所述筛选培养基成分如下MS基础培养基+6-BA 2～5mg·L-1+NAA 1～4mg·L-1+TDZ 0.1～1mg·L-1+Cef250～500mg·L-1+Hyg 5～20mg·L-1蔗糖20～60g·L-1+琼脂8～16g·L-1，pH5.2～5.8，118～125℃高压灭菌20～30min；筛选培养条件如下：22～26℃光照培养，每天光照12～14h，光照强度1500～2500lx，培养20～50天。6.如权利要求1所述的建立农杆菌介导灯盏花高效转染体系的方法，其特征在于，分化培养阶段：所述分化培养基A成分如下：SH基础配方+6-BA 0.1～2mg·L-1+NAA 0.1～2mg·L-1+Ade40～150mg·L-1+Glu 5～20mg·L-1+CH 0.5～3g·L-1+Cef 50～300mg·L-1+Hyg 3～15mg·L-1+蔗糖20～60g·L-1+琼脂8～16g·L-1，pH 5.2～5.8， 118～125℃灭菌20～...

【专利技术属性】
技术研发人员：于洋，李星沁，张业胜，董扬，
申请(专利权)人：云南纳博生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：云南;53