一种建立农杆菌介导观音莲高效转染体系的方法技术

本发明专利技术公开一种建立农杆菌介导观音莲高效转染体系的方法，所述方法包括以下步骤：侵染和共培养阶段：将观音莲无菌苗叶片块放入三角瓶中，倒入农杆菌菌液，三角瓶口密封进行侵染，侵染后倒去菌液，将叶片晾干，转接到共培养培养基中进行暗培养得到愈伤组织；筛选阶段：将共培养获得的愈伤组织转接到筛选培养基中进行两次筛选得到幼芽；抗性苗培养阶段：将获得的幼芽转接到抗性苗培养基培养得到抗性苗；阳性苗检测阶段。本发明专利技术使用农杆菌介导观音莲转化，打通观音莲农杆菌介导高效转染体系，这是通过农杆菌转染体系培育新型观音莲最为重要的一步。本发明专利技术能够突破观音莲自身遗传屏障，获得难以通过传统育种方式生产的新品种。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于农杆菌介导植物转染体系
，尤其涉及一种建立农杆菌介导观音莲高效转染体系的方法。
技术介绍
观音莲(Sempervivum tectorum)，景天科长生草属多肉植物，也叫做长生草、观音座莲、佛座莲。原产于西班牙、法国、意大利等欧洲国家的山区，属于高山多肉植物。是一种以观叶为主的小型多肉植物，也是销量比较大的多肉植物之一，中国各地都很普及。是多肉植物中最常见的品种之一堪称普货之王。观音莲肉如其名，叶片莲座状环生，其株形端庄，犹如一朵盛开的莲花。叶片扁平细长，叶端渐尖，叶缘有小绒毛，充分光照下，叶端形成非常漂亮咖啡色或紫红色；若光照不充足，则叶端只为深绿色。其品种很多，叶盘直径从3-15厘米都有，发育良好的植株在大莲座下面会着生一圈小莲座，此外每年的春末还会从叶丛下部抽出类似吊兰的红色走茎，走茎前端长有莲座状小叶丛。长生草的小花呈星状，粉红色。观音莲叶色富于变化，紫红色的叶尖极为别致，适合做中小型盆栽或组合盆栽，用不同造型的花盆栽种，其观赏效果也相差很大，用卡通型的花盆栽种，活泼可爱，深受孩子们的欢迎；用紫砂盆或青花瓷器盆种植，端庄大方，颇受中老年人的青睐；而栽于木质的小花盆，时尚自然，很受年轻人的喜爱。农杆菌介导的植物基因转化系统目前广泛应用于植物基因工程研究。根癌农杆菌中含Ti质粒，该质粒的部分DNA片段可整合到宿主细胞中，从而整合到植物的基因组中，农杆菌介导的转染方法同其他方法相比具有以下优点：转化效率高，转化效果好，可转移大片段DNA；转移的外援基因成为单拷贝；遗传稳定，并且多数符合孟德尔遗传定律；价格低廉。目前在观音莲生产中还没有使用农杆菌进行转化的报道，使用农杆菌介导观音莲转化，可以使观音莲快速获得目的性状，而且可以突破观音莲自身遗传屏障，获得难以通过传统育种方式生产的新品种。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术提供一种建立农杆菌介导观音莲高效转染体系的方法，本专利技术使用农杆菌介导观音莲转化，打通观音莲农杆菌介导高效转染体系，这是通过农杆菌转染体系培育新型观音莲最为重要的一步。建立观音莲农杆菌介导高效转染体系意味着能够突破观音莲自身遗传屏障，获得难以通过传统育种方式生产的新品种。本专利技术的技术方案如下：一种建立农杆菌介导观音莲高效转染体系的方法，所述方法包括以下步骤：侵染和共培养阶段：将观音莲无菌苗叶片切成小块放入三角瓶中，加入菌液，瓶口密封，真空条件下侵染，侵染后倒去菌液，将叶片晾干，转接到共培养培养基中进行共培养；所述侵染条件如下：真空度为0.2～1.0Kpa，侵染时间为12～48h；所述共培养条件如下：所述共培养为暗培养，培养温度为20～28℃，培养时间为3～7天。所述共培养培养基为：SH基础配方+2,4-D 0.20～0.30mg·L-1+NAA1.0～5.0mg·L-1+6-BA1.0～5.0mg·L-1+KT 0.1～1.0mg·L-1+GA3 0.1～1.0mg·L-1+蔗糖10～30g·L-1+葡萄糖5～15g·L-1+琼脂5.0～10.0g·L-1+AS 100～200μmol·L-1，pH5.2～6.0，118～125℃灭菌20～30min；SH基础配方：硝酸钾2～5.0g·L-1，硫酸镁0.1～0.4g·L-1，磷酸二氢铵0.3～0.6g·L-1，氯化钙150～300mg·L-1，甘氨酸2～4mg·L-1，肌醇100～200mg·L-1，盐酸硫胺素0.4～0.8mg·L-1，盐酸吡哆素0.5～1.0mg·L-1，烟酸0.5～1.0mg·L-1，乙二胺四乙酸铁纳10～40mg·L-1，六水氯化钴0.1～0.2mg·L-1，五水硫酸铜0.2～0.4mg·L-1，硼酸5～10mg·L-1，碘化钾1～2mg·L-1，一水硫酸锰10～20mg·L-1，二水钼酸钠0.1～0.2mg·L-1，七水硫酸锌1～2mg·L-1。筛选阶段：将共培养获得的愈伤组织转接到筛选培养基中进行两次筛选培养得到幼芽；进一步地，共培养获得的愈伤组织在延迟筛选培养基中进行延迟筛选培养，培养10～15天后，更换筛选培基进行筛选培养，培养20～30天得到幼芽；所述延迟筛选培养基成分如下：SH基础配方+2.4-D 0.2～0.3mg·L-1+NAA1.0～5.0mg·L-1+6-BA 1.0～5.0mg·L-1+KT 0.1～1.0mg·L-1+GA3 0.1～1.0mg·L-1+蔗糖10～50g·L-1+琼脂5～10g·L-1+cef 100～500mg·L-1+carb 100～500mg·L-1，pH5.2～6.0，118～125℃高压灭菌20～30min；筛选培养基成分如下：SH基础配方+2,4-D 0.2～3.0mg·L-1+NAA 1.0～5.0mg·L-1+6-BA 1.0～5.0mg·L-1+KT 0.1～1.0mg·L-1+GA3 0.1～1.0mg·L-1+蔗糖10～50g·L-1+琼脂5～10g·L-1+cef 100～500mg·L-1+carb 100～500mg·L-1+Hyg 5～20mg·L-1，pH 5.2～6.0，118～125℃高压灭菌20～30min；所述延迟筛选培养与筛选培养条件如下：22～28℃光照培养，每天光照12～16h，光照强度1500～2500lx。抗性苗培养阶段：将获得的幼芽转接到抗性苗培养基培养得到抗性苗；进一步地，幼芽在抗性苗培养基中培养20～25天后更换一次抗性苗培养基加速抗性苗生长；所述抗性苗培养基成分如下：SH基础配方+蔗糖10～50g·L-1+琼脂5～10g·L-1+cef 100～500mg·L-1+carb 100～500mg·L-1，pH 5.2～6.0，118～125℃高压灭菌20～30min。抗性苗培养条件如下：22～28℃光照培养7～8周，光照强度为1500～2500lx，光照时间为12～16h/天。阳性苗检测阶段：取获得的抗性苗的叶片，提取DNA，进行PCR扩增，将PCR产物进行凝胶电泳，得到农杆菌成功侵染观音莲的阳性苗，建立农杆菌介导观音莲高效转染体系。无菌苗获得阶段将观音莲腋芽消毒灭菌后将叶片撕下切为两段接种于诱导直接分化培养基中培养获得愈伤组织，更换一次诱导直接分化培养基培养获得小芽，将小芽移至基础培养基获得无菌苗；所述观音莲腋芽消毒杀菌过程如下：剪取大棚种植的观音莲植株上的腋芽，使用无菌水冲洗5～12次，75％酒精浸泡1～3min，无菌水洗5～12次，在0.1～0.5％升汞中浸泡5～15min，无菌水洗5～15次，无菌滤纸上晾干；进一步地，可以根据需要进行扩繁，无菌苗扩繁阶段：将无菌苗获得阶段萌发长到3～5cm的无菌苗的叶片切为两段接种到诱导直接分化培养基培养获得愈伤组织后更换一次诱导直接分化培养基培养获得小芽，将小芽移至基础培养基扩繁得到无菌苗；所述诱导直接分化培养基的成分如下：SH基础配方+2,4-D 0.10～1mg·L-1+NAA 0.5～5.0mg·L-1+6-BA 0.5～5.0mg·L-1+KT 0.1～1.0mg·L-1+GA3 0.1～1.0mg·L-1+蔗糖10.0～50.0g·L-1+琼脂5.0～10.0g·L-1，pH 5.2～6.0，118～125℃高压灭菌20～30mi本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种建立农杆菌介导观音莲高效转染体系的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：侵染和共培养阶段：将观音莲无菌苗叶片切成小块放入三角瓶中，加入菌液，瓶口密封，真空条件下侵染，侵染后倒去菌液，将叶片晾干，转接到共培养培养基中进行共培养；筛选阶段：将共培养获得的愈伤组织转接到筛选培养基中进行两次筛选培养得到幼芽；抗性苗培养阶段：将获得的幼芽转接到抗性苗培养基培养得到抗性苗；阳性苗检测阶段：取获得的抗性苗的叶片，提取DNA，进行PCR扩增，将PCR产物进行凝胶电泳，得到农杆菌成功侵染观音莲的阳性苗，建立农杆菌介导观音莲高效转染体系。

【技术特征摘要】
1.一种建立农杆菌介导观音莲高效转染体系的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：侵染和共培养阶段：将观音莲无菌苗叶片切成小块放入三角瓶中，加入菌液，瓶口密封，真空条件下侵染，侵染后倒去菌液，将叶片晾干，转接到共培养培养基中进行共培养；筛选阶段：将共培养获得的愈伤组织转接到筛选培养基中进行两次筛选培养得到幼芽；抗性苗培养阶段：将获得的幼芽转接到抗性苗培养基培养得到抗性苗；阳性苗检测阶段：取获得的抗性苗的叶片，提取DNA，进行PCR扩增，将PCR产物进行凝胶电泳，得到农杆菌成功侵染观音莲的阳性苗，建立农杆菌介导观音莲高效转染体系。2.如权利要求1所述的建立农杆菌介导观音莲高效转染体系的方法，其特征在于，侵染条件如下：真空度为0.2～1.0Kpa，侵染时间为1～2h；共培养条件如下：所述共培养为暗培养，培养温度为20～28℃，培养时间为3～7天。3.如权利要求1所述的建立农杆菌介导观音莲高效转染体系的方法，其特征在于，所述共培养培养基为：SH基础配方+2,4-D 0.20～0.30mg·L-1+NAA 1.0～5.0mg·L-1+6-BA 1.0～5.0mg·L-1+KT 0.1～1.0mg·L-1+GA3 0.1～1.0mg·L-1+蔗糖10～30g·L-1+葡萄糖5～15g·L-1+琼脂5.0～10.0g·L-1+AS 100～200μmol·L-1，pH5.2～6.0，118～125℃灭菌20～30min。4.如权利要求1所述的建立农杆菌介导观音莲高效转染体系的方法，其特征在于，筛选阶段：共培养获得的愈伤组织在延迟筛选培养基中进行延迟筛选培养，培养10～15天后，更换筛选培基进行筛选培养，培养20～30天得到幼芽；所述延迟筛选培养基成分如下：SH基础配方+2.4-D 0.2～0.3mg·L-1+NAA 1.0～5.0mg·L-1+6-BA 1.0～5.0mg·L-1+KT 0.1～1.0mg·L-1+GA3 0.1～1.0mg·L-1+蔗糖10～50g·L-1+琼脂5～10g·L-1+cef 100～500mg·L-1+carb 100～500mg·L-1，pH 5.2～6.0，118～125℃高压灭菌20～30min；筛选培养基成分如下：SH基础配方+2,4-D 0.2～3.0mg·L-1+NAA 1.0～5.0mg·L-1+6-BA 1.0～5.0mg·L-1+KT 0.1～1.0mg·L-1+GA3 0.1～1.0mg·L-1+蔗糖10～50g·L-1+琼脂5～10g·L-1+cef 100～500mg·L-1+carb 100～500mg·L-1+Hyg 5～20mg·L-1，pH 5.2～6.0，118～125...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈海涛，生承晔，张业胜，董扬，
申请(专利权)人：云南纳博生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：云南;53