利用外切葡聚糖酶提高水稻秸秆降解转化效率的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用外切葡聚糖酶提高水稻秸秆降解转化效率的方法，属于转纤维素酶水稻的分子生物学技术方法。本方法是：①从里氏木霉中克隆CBHⅠ基因全长cDNA，并根据水稻密码子使用频率表，用定点突变的方法对CBHⅠ基因的密码子进行优化；②构建CBHⅠ基因在叶绿体中通过光诱导表达的载体，并转化水稻中花11，获得转基因植株；③将获得的水稻转CBHⅠ基因材料的秸秆粉末经外源纤维素复合酶和1%Tween 80处理，测定己糖产量。④测定获得的转基因水稻 CBHⅠ的秸秆的细胞壁纤维素含量。本发明专利技术对CBHⅠ基因的密码子进行了优化；增加外源CBHⅠ基因在水稻中的表达量，使转基因水稻秸秆降解转化效率提高84.94%。

【技术实现步骤摘要】
利用外切葡聚糖酶提高水稻秸秆降解转化效率的方法
本专利技术涉及构建转纤维素酶基因水稻的方法，属于转纤维素酶水稻的分子生物学
，具体涉及一种利用外切葡聚糖酶提高水稻秸秆降解转化效率的方法。
技术介绍
纤维素酶广泛存在于多种微生物中，由以下三种酶组成：(1)内切-1，4-β-D-葡聚糖酶(endo-1,4-β-D-glucanases,EC3.2.1.4,EG)，它作用于纤维素链上的β-1,4-葡聚糖苷键，随机水解无定形纤维素，释放纤维寡糖形成新的还原端；(2)1，4-β-D-纤维二糖水解酶或外切葡聚糖酶(1,4-β-D-cellobiohydrolases或exoglucanase,EC3.2.1.91,CBH)，它沿着纤维素链行进，从还原端或非还原端水解结晶纤维素，释放纤维二糖；(3)1,4-β-D-葡萄糖苷酶(1,4-β-D-glucosidases,EC3.2.1.21,BGL)，主要水解纤维二糖、纤维寡糖和其它低聚糖，产生葡萄糖[1](Warrenetal.,1996)。纤维素通过这三种酶的协同作用，最终降解为葡萄糖。目前，绝大多数商业纤维素酶都产自木霉，小部分产自黑曲霉。虽然在纤维素酶菌株的选育、纤维素酶组分及降解机制、纤维素酶合成的调节与调控以及纤维素酶应用等诸多分支课题都取得了重要进展，但迄今尚未找到一种微生物或酶来有效利用纤维素这一巨大的可再生资源[2](靳振江等，2007)。最近几年，利用转基因植物作为生物反应器生产纤维素酶成为一种更具潜力的发展方向[3](王炜，2007)。以转基因植物作为生物反应器生产纤维素酶具有以下优势：首先是表达酶的转基因植物可以用作饲料原料，直接饲喂，或者直接作为生物乙醇的生物质原料而省去或减少目前酶制剂的发酵生产和添加；其次是生产规模不受限制，成本比较低[4，5](Whitelametal.,1993；Himmeletal.,2007)。来源于微生物的内切葡聚糖酶，外切葡聚糖酶和来自人类的β-葡萄糖苷酶已相继在多种作物中得到表达，CBHI在植物体内表达的研究进展见表1。迄今为止，尚无在植物体内表达外切葡聚糖酶对植物秸秆降解转化效率影响的报道。表1.CBHI在植物体内的表达参考文献：1.WarrenRAJ.Microbialhydrolysisofpolysaccharides.AnnualReview.Microbiology,1996,50:183–2122.靳振江.纤维素酶降解纤维素的研究进展.广西农业科学，2007，38(2)：127-1303.王炜.在转基因水稻种子里表达生产纤维素酶.浙江大学硕士学位论文.20074.WhitelamGC,CockburnB,GandechaAR,OwenMR.HeterologousproteinproductioninTransgenicplantsWhitelam.BiotechnologyandGeneticEngineeringReviews,1993,11:1-295.HimmelME,DingSY,JohnsonDK,etal.Biomassrecalcitrance.Engineeringplantsandenzymesforbiofuelsproduction.Science,2007,315:804-807.6.Ziegelhoffer,T.,Will,J.andAustin-Phillips,S.Expressionofbacterialcellulasegenesintransgenicalfalfa(MedicagosativaL.),potato(SolanumtuberosumL.)andtobacco(NicotianatabacumL.).MolecularBreeding,1999,5:309–318.7.蒋西然.耐高温纤维素酶在烟草中的表达.大连理工大学硕士学位论文.20118.DaiZ,HookerBS,QuesenberryRD,GaoJ.ExpressionofTrichodermareeseiexo-cellobiohydrolaseIintransgenictobaccoleavesandcalli.AppliedBiochemistryandBiotechnology,1999,77:689-6999.HoodEE,LoveR,LaneJ,BrayJ,CloughR,PappuK,DreesC,HoodKR,YoonS,AhmadA,HowardJA.Subcellulartargetingisakeyconditionforhigh‐levelaccumulationofcellulaseproteinintransgenicmaizeseed.PlantBiotechnologyJournal,2007,5(6):709-719.
技术实现思路
本专利技术的目的就在于克服现有技术存在的缺点和不足，提供一种利用外切葡聚糖酶提高水稻秸秆降解转化效率的方法，即利用转基因技术对水稻细胞壁进行遗传改良，提高秸秆生物质的可降解性，减少外源添加的纤维素酶用量，为利用植物生产纤维素乙醇做理论以及技术上的探索。本专利技术的目的是这样实现的：一、利用外切葡聚糖酶提高水稻秸秆降解转化效率的方法(简称方法)本方法包括下列步骤：①从里氏木霉中克隆CBHⅠ基因全长cDNA，并根据水稻密码子使用频率表，用定点突变的方法对CBHⅠ基因的密码子进行优化，即将外切葡聚糖酶CBHⅠ的第77位亮氨酸的密码子CTA优化为CTC，将第319位精氨酸的密码子CGA优化为CGC，如序列1；②构建CBHⅠ基因在叶绿体中通过光诱导表达的载体，并转化水稻中花11，获得转基因水稻CBHⅠ；③将获得的转基因水稻CBHⅠ的秸秆粉末经外源纤维素复合酶和1％Tween80处理，测定己糖产量；④测定获得的转基因水稻CBHⅠ的秸秆的细胞壁纤维素含量。所述的步骤①：一种外切葡聚糖酶(exoglucanase，或纤维二糖水解酶cellobiohydrolase，EC3.2.1.91,CBH)基因Ⅰ编码区序列，如序列1，CDS长度为1545bp，该基因来源于里氏木霉，根据水稻密码子使用频率表，将CBHⅠ基因中使用频率小于15％的密码子，用定点突变的方法优化为水稻中的常用密码子。所述的步骤②：植物表达载体为pC1300T-osrbcs-chl-CBHⅠful，其中所带的基因来源于序列1(不包括CBHⅠ信号肽序列和包含部分3’非编码区序列，长度为1599bp)；根据表达载体转化水稻，获得转基因水稻植株的方法。转基因水稻CBHⅠ于2016年11月03日保藏在中国典型培养物保藏中心(地址：中国武汉武汉大学邮编：430072)，保藏编号为CCTCCNO：P201623。所述的步骤③：表达载体在培育高降解转化效率植物材料中的应用。所述的步骤④测定获得的转基因水稻CBHⅠ的秸秆的细胞壁纤维素含量。本专利技术具有下列优点和积极效果：1、对CBHⅠ基因的密码子进行了优化；2、增加外源CBHⅠ基因在水稻中的表达量，使转基因水稻秸秆降解转化效率提高84.94％。附图说明图1是外源纤维素酶和1％Tween80处理转基因水稻秸秆的酶解效率；图2是定点突变方法示意本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用外切葡聚糖酶提高水稻秸秆降解转化效率的方法，其特征在于：①从里氏木霉中克隆CBHⅠ基因编码区序列（不包括信号肽），并根据水稻密码子使用频率表，用定点突变的方法对CBHⅠ基因的密码子进行优化，即将外切葡聚糖酶CBHⅠ的第77位亮氨酸的密码子 CTA优化为CTC，将第319位精氨酸的密码子CGA优化为CGC；②构建CBHⅠ基因在叶绿体中通过光诱导表达的载体，并转化水稻中花11，获得转基因植株；③将获得的转基因水稻 CBHⅠ的秸秆粉末经外源纤维素复合酶和1%Tween 80处理，测定己糖产量；④测定获得的转基因水稻 CBHⅠ的秸秆的细胞壁纤维素含量。

【技术特征摘要】
1.一种利用外切葡聚糖酶提高水稻秸秆降解转化效率的方法，其特征在于：①从里氏木霉中克隆CBHⅠ基因编码区序列（不包括信号肽），并根据水稻密码子使用频率表，用定点突变的方法对CBHⅠ基因的密码子进行优化，即将外切葡聚糖酶CBHⅠ的第77位亮氨酸的密码子CTA优化为CTC，将第319位精氨酸的密码子CGA优化为CGC；②构建CBHⅠ基因在叶绿体中通过光诱导表达的载体，并转化水稻中花11，获得转基因植株；③将获得的转基因水稻CBHⅠ的秸秆粉末经外源纤维素复合酶和1%Tween80处理，测定己糖产量；④测定获得的转基因水稻CBHⅠ的秸秆的细胞壁纤维素含量。2.按权利要求1所述的的方法，其特征在于所述的步骤①：一种外切葡聚糖酶（exoglucanase，或纤维二糖水解酶cellobiohydrolase，EC3.2.1.91,CBH）基因Ⅰ编码区序列，如序列1，CDS长度为1545bp，该基因来源于里氏木...

【专利技术属性】
技术研发人员：彭良才，丰胜求，谢国生，王令强，王艳婷，李英，范春芬，孙海燕，胡慧贞，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42