一种培育抗TYLCV病毒的番茄的方法、载体及其应用技术

本发明专利技术提供一种培育抗TYLCV病毒的番茄的方法，包括：1)提供包含核酸内切酶系统的编码序列的DNA序列，其中所述核酸内切酶系统包括导向部分和核酸内切酶活性部分，所述核酸内切酶活性部分本身不具有识别特定核酸序列的功能，其在所述导向部分的作用下能够特异性地切断TYLCV病毒的DNA分子；以及2)通过转基因方法将包含核酸内切酶系统的编码序列的DNA插入番茄的基因组中，使所述番茄表达所述核酸内切酶系统，从而使所述番茄获得抗TYLCV病毒的能力。本发明专利技术还提供了在所述方法中使用的载体和该载体的应用。使用本发明专利技术的方法成功地获得了具有抗TYLCV病毒的能力的番茄品种。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于植物基因工程领域，具体而言，涉及培育抗TYLCV病毒的番茄的方法、载体及其应用。
技术介绍
番茄(Lycopersicon esculentum Mill.)是大众喜欢的重要蔬菜，但在番茄生长过程中极其容易感染番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl virus，TYLCV)。TYLCV属于双生病毒科(Geminiviridae)菜豆金色花叶病毒属(Begomovirus)病毒，病毒基因组是一个2.7-2.8kb的单链环状DNA，有时还伴有卫星病毒。番茄感染病毒后的症状主要表现为叶片上卷、叶缘及叶脉之间黄化，最后会表现出叶片变小、植株矮化等症状。TYLCV在我国及世界番茄产区广泛流行，对番茄的产量和品质影响极大，经常给番茄生产造成严重的损失，甚至造成绝产绝收。TYLCV在自然条件下通过烟粉虱(Bemisia tabaci)传播。烟粉虱繁殖力强，而且寄主广泛，几乎涵盖所有常见蔬菜、多种花卉等农作物，很难将TYLCV限制在一个地点，阻止其传播与扩散。TYLCV早在1930年在以色列发现，目前在世界上的所有番茄产区均有发现报道。因此，培育抗TYLCV的优良品种，是消除TYLCV危害的主要途径。近年来，通过重组构建人工核酸酶，能定点切开基因组DNA，从而成功实现对植物基因组的定点、定位修饰。最先出现的是锌指核酸酶(Zinc finger nuclease，ZFN)，ZFN技术通过锌指蛋白的锌指域识别特定的DNA序列，与II型限制性内切酶FokI的核酸酶活性域重组，构建成人工重组锌指核酸酶。该重组锌指核酸酶通过其锌指域结合特定的基因组DNA位点，然后来自FokI的核酸酶活性域便能切断该位点附近的DNA。在ZFN不久之后的2012年，出现了类转录激活子样效应因子核酸酶(Transcription activator-like effector nuclease，TALEN技术)。它基于与ZFN类似的原理，利用TALE(Transcription activator-like effector)蛋白的特异识别DNA碱基的功能域与FokI核酸酶的酶切活性域组合成重组蛋白(TALE nucleases，TALEN)。这样，TALE具有特异性识别基因组特定DNA位点的能力，而FokI的核酸酶活性域便能切断该位点附近的DNA。与ZFN不同的是，TALEN更容易人为地改变其识别并结合DNA碱基序列的能力，从而设计出剪切基因组不同DNA位点的重组核酸酶。到2013年，出现了能剪切基因组DNA的另一技术，即CRISPR/Cas(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated proteins)。CRISPR/Cas是存在于细菌和古细菌中的一种适应性免疫防御系统，专门用来对抗入侵细菌的噬菌体的外源DNA。CRISPR/Cas系统通过将入侵细菌的噬菌体DNA的片段整合到CRISPR中，并利用相应的CRISPR RNAs(crRNAs)来指导入侵细菌的噬菌体外源DNA同源序列的降解，从而消灭入侵噬菌体。依此原理，开发出用于高等生物基因组DNA剪切的是其中的一种，即CRISPR/Cas9。其功能与上述ZFN技术及TALEN技术相同，但操作更简便，使用更灵活。在2015年，基于CRISPR/Cas的技术出现了新的称之为Cpf1的技术，它与CRISPR/Cas9极为相似，都是通过转录的RNA结合特定DNA，然后对目标DNA进行剪切。目前仍然需要更好的方法来培育抗TYLCV的优良番茄品种。
技术实现思路
为了有效培育出抗TYLCV病毒的番茄，本专利技术提供了基于核酸内切酶降解入侵番茄细胞的TYLCV病毒的方法、载体及其应用。具体而言，本专利技术提供了：(1)一种培育抗TYLCV病毒的番茄的方法，包括：1)提供包含核酸内切酶系统的编码序列的DNA序列，其中所述核酸内切酶系统包括导向部分和核酸内切酶活性部分，所述核酸内切酶活性部分本身不具有识别特定核酸序列的功能，其在所述导向部分的作用下能够特异性地切断TYLCV病毒的DNA分子；以及2)通过转基因方法将包含所述核酸内切酶系统的编码序列的DNA插入番茄的基因组中，使所述番茄表达所述核酸内切酶系统，从而使所述番茄获得抗TYLCV病毒的能力。(2)根据(1)所述的方法，其中所述核酸内切酶系统为重组核酸内切酶，该重组核酸内切酶包括TYLCV病毒的C1蛋白的N末端作为所述导向部分、以及核酸内切酶的切割活性区作为所述核酸内切酶活性部分，其中所述C1蛋白的N末端能够特异性识别并结合TYLCV病毒的DNA的复制起点区域。(3)根据(2)所述的方法，其中所述C1蛋白的N末端的核苷酸序列如以下所述：a)如序列表SEQ ID No.2所示；b)与序列表SEQ ID No.2所示核苷酸序列的DNA具有至少90％的相似性；或者c)能够与序列表SEQ ID No.2所示核苷酸序列的DNA杂交，并且为TYLCV病毒的DNA的一部分；其中如以上a)或b)或c)所述的核苷酸序列的DNA能够编码能够特异性识别并结合TYLCV病毒的DNA的复制起点的所述C1蛋白的N末端。(4)根据(2)所述的方法，其中所述C1蛋白的N末端如以下所述：d)其氨基酸序列如序列表SEQ ID No.3所示；或者e)其氨基酸序列在序列表SEQ ID No.3的基础上经过氨基酸残基的添加和/或替换和/或删除，并且所述C1蛋白的N末端能够特异性识别并结合TYLCV病毒的DNA的复制起点。(5)根据(2)所述的方法，其中所述核酸内切酶的切割活性区为限制性内切酶的切割活性区。(6)根据(2)所述的方法，其中所述核酸内切酶的切割活性区为Eco31I的切割活性区，并且核苷酸序列如以下所述：i)如序列表SEQ ID No.4所示；ii)与序列表SEQ ID No.4所示核苷酸序列的DNA具有至少90％的相似性，并且能够编码具有核酸内切酶活性的Eco31I的切割活性区；或者iii)能够与序列表SEQ ID No.4所示核苷酸序列的DNA杂交，并且能够编码具有核酸内切酶活性的Eco31I的切割活性区。(7)根据(6)所述的方法，其中所述Eco31I的切割活性区如以下所述：iv)其氨基酸序列如序列表SEQ ID No.5所示；或者v)其氨基酸序列在序列表SEQ ID No.5的基础上经过氨基酸残基的添加和/或替换和/或删除，并且具有所述Eco31I的切割活性区的活性。(8)根据(2)所述的方法，其中所述核酸内切酶的切割活性区为SMR切割活性区，并且核苷酸序列如以下所述：I)如序列表SEQ ID No.6所示；II)与序列表SEQ ID No.6所示核苷酸序列的DNA具有至少90％的相似性，并且能够编码具有核酸内切酶活性的SMR切割活性区；或者III)能够与序列表SEQ ID No.6所示核苷酸序列的DNA杂交，并且能够编码具有核酸内切酶活性的SMR切割活性区。(9)根据(8)所述的方法，其中所述SMR切割活性区如以下所述：IV)其氨基酸序列如序列表SEQ ID No.7所示；或者V)其氨基酸序列在序列表SEQ ID本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种培育抗TYLCV病毒的番茄的方法，包括：1)提供包含核酸内切酶系统的编码序列的DNA序列，其中所述核酸内切酶系统包括导向部分和核酸内切酶活性部分，所述核酸内切酶活性部分本身不具有识别特定核酸序列的功能，其在所述导向部分的作用下能够特异性地切断TYLCV病毒的DNA分子；以及2)通过转基因方法将包含所述核酸内切酶系统的编码序列的DNA插入番茄的基因组中，使所述番茄表达所述核酸内切酶系统，从而使所述番茄获得抗TYLCV病毒的能力。

【技术特征摘要】
1.一种培育抗TYLCV病毒的番茄的方法，包括：1)提供包含核酸内切酶系统的编码序列的DNA序列，其中所述核酸内切酶系统包括导向部分和核酸内切酶活性部分，所述核酸内切酶活性部分本身不具有识别特定核酸序列的功能，其在所述导向部分的作用下能够特异性地切断TYLCV病毒的DNA分子；以及2)通过转基因方法将包含所述核酸内切酶系统的编码序列的DNA插入番茄的基因组中，使所述番茄表达所述核酸内切酶系统，从而使所述番茄获得抗TYLCV病毒的能力。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述核酸内切酶系统为重组核酸内切酶，该重组核酸内切酶包括TYLCV病毒的C1蛋白的N末端作为所述导向部分、以及核酸内切酶的切割活性区作为所述核酸内切酶活性部分，其中所述C1蛋白的N末端能够特异性识别并结合TYLCV病毒的DNA的复制起点区域。3.根据权利要求2所述的方法，其中所述C1蛋白的N末端的核苷酸序列如以下所述：a)如序列表SEQ ID No.2所示；b)与序列表SEQ ID No.2所示核苷酸序列的DNA具有至少90％的相似性；或者c)能够与序列表SEQ ID No.2所示核苷酸序列的DNA杂交，并且为TYLCV病毒的DNA的一部分；其中如以上a)或b)或c)所述的核苷酸序列的DNA能够编码能够特异性识别并结合TYLCV病毒的DNA的复制起点的所述C1蛋白的N末端。4.根据权利要求2所述的方法，其中所述C1蛋白的N末端如以下所述：d)其氨基酸序列如序列表SEQ ID No.3所示；或者e)其氨基酸序列在序列表SEQ ID No.3的基础上经过氨基酸残基的添加和/或替换和/或删除，并且所述C1蛋白的N末端能够特异性识别并结合TYLCV病毒的DNA的复制起点。5.根据权利要求2所述的方法，其中所述核酸内切酶的切割活性区为限制性内切酶的切割活性区。6.根据权利要求2所述的方法，其中所述核酸内切酶的切割活性区为Eco31I的切割活性区，并且核苷酸序列如以下所述：i)如序列表SEQ ID No.4所示；ii)与序列表SEQ ID No.4所示核苷酸序列的DNA具有至少90％的相似性，并且能够编码具有核酸内切酶活性的Eco31I的切割活性区；或者iii)能够与序列表SEQ ID No.4所示核苷酸序列的DNA杂交，并且能够编码具有核酸内切酶活性的Eco31I的切割活性区。7.根据权利要求6所述的方法，其中所述Eco31I的切割活性区如以下所述：iv)其氨基酸序列如序列表SEQ ID No.5所示；或者v)其氨基酸序列在序列表SEQ ID No.5的基础上经过氨基酸残基的添加和/或替换和/或删除，并且具有所述Eco31I的切割活性区活性。8.根据权利要求2所述的方法，其中所述核酸内切酶的切割活性区为SMR切割活性区，并且核苷酸序列如以下所述：I)如序列表SEQ ID No.6所示；II)与序列表SEQ ID No.6所示核苷酸序列的DNA具有至少90％的相似性，并且能够编码具有核酸内切酶活性的SMR切割活性区；或者III)能够与序列表SEQ ID No.6所示核苷酸序列的DNA杂交，并且能够编码具有核酸内切酶活性的SMR切割活性区。9.根据权利要求8所述的方法，其中所述SMR切割活性区如以下所述：IV)其氨基...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈克贵，彭梅芳，高永峰，范晓丽，纳顺贵，
申请(专利权)人：成都依农农业科技有限公司，四川省农业科学院生物技术核技术研究所，
类型：发明
国别省市：四川;51