一种生防用解淀粉芽孢杆菌菌株及其用途制造技术

本发明专利技术公开了一种生防用解淀粉芽孢杆菌菌株及其用途，该菌Bacillus amyloliquefaciens B4保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No：13466。本发明专利技术包括菌株的分离培养及16S rDNA分子鉴定；解淀粉芽孢杆菌培养后，不同活性物质(包括其发酵液、上清液、菌悬液)的获得；在体外，不同的活性产物对常见水果表面的腐败真菌(青霉、链格孢)的抑制效果；在体内，枇杷、梨、樱桃番茄、苹果贮藏中的防腐应用。本发明专利技术筛选的解淀粉芽孢菌株及其产物能对多种水果采后腐败产生有效抑制，可用于制备一种抑制青霉、链格孢等腐败菌且具有较宽抑菌谱的生防用保鲜剂。

Bacillus subtilis strain for biological prevention and use thereof

The invention discloses a biocontrol with Bacillus amyloliquefaciens strain and its use, the Bacillus amyloliquefaciens B4 bacteria preserved in general microbial culture collection center Chinese Management Committee for the preservation of CGMCC No:13466. The present invention includes isolation and 16S rDNA molecular identification of strains of Bacillus amyloliquefaciens; after cultured with different active substances (including the fermentation liquid, supernatant and bacterial suspension) is obtained; in vitro antifungal activity of different products of corruption common fruit surface (Penicillium, Alternaria) inhibitory effect; in vivo, preservation of loquat, pear, cherry tomato, Apple during storage. The starch and its products can effectively inhibit Bacillus strains of a variety of fruit postharvest corruption screening solution of the invention can be used for preparing a inhibition of Penicillium, Alternaria and other spoilage bacteria and has a wide spectrum of antimicrobial antistaling agent for biocontrol.

【技术实现步骤摘要】
一种生防用解淀粉芽孢杆菌菌株及其用途
本专利技术涉及一株解淀粉芽孢杆菌对多种水果采后病害进行防治的生物
，具体施用的是一种生防用解淀粉芽孢杆菌菌株及其在果品贮藏中的应用。
技术介绍
水果采后病害导致的巨大损耗已成为国内外关注的问题，在发达国家约有10％～30％的新鲜果品由于采后病害导致腐烂损失，在发展中国家果品的采后腐烂更为严重。目前，水果采后病害的防治方法主要有化学杀菌剂、气调贮藏、低温防病、热处理等，其中化学防腐效果最好。生物防治没有化学防腐保鲜带来的环境污染、农药残留及连续使用产生抗药性的问题，因此其成为果蔬采后病害防治的主要手段。水果采后腐败主要由霉菌等微生物污染引起，引起梨、樱桃番茄、枇杷腐败的真菌主要有青霉、链格孢菌、灰葡萄孢菌、炭疽真菌等。芽孢杆菌是目前生防用细菌中研究较多的一类，因其能够产生耐热、耐旱、抗紫外线和有机溶剂的内生孢子，所以是理想的生防用筛选对象。其主要防治对象为丝状真菌所引起的植物病害，如番茄叶霉病(腐败菌：黄枝孢菌Cladosporiumfulvum)、苹果霉心病(腐败菌：链格孢菌Alternariaalternate)等。芽孢杆菌的生防用作用机制主要有营养和空间位点竞争、分泌抗菌物质(如脂肽类抗生素伊枯草菌素、生物表面活性素、丰原素和蛋白类抗菌物质)、溶菌作用、诱导抗性。解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)为芽孢杆菌属，是一种与枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)亲缘性很高的细菌，其在生长过程中可以产生一系列能够抑制真菌和细菌活性的代谢物。2007年公布的解淀粉芽孢杆菌FZB42的全基因组测序使得人们对这种具有多种次生代谢物生产能力的芽孢杆菌有了更深层次的认识，促进了解淀粉芽孢杆菌的生物利用。然而将解淀粉芽孢杆菌菌体运用到多种水果采后的防腐保鲜的研究却鲜有报道，本专利技术主要是将解淀粉芽孢杆菌的不同活性成分作为保鲜剂，喷洒到多种易腐水果表面，如枇杷、梨、苹果、樱桃番茄，来观察其保鲜效果。参考文献：1.李红晓,张殿朋,卢彩鸽,等.2016.生防用解淀粉芽孢杆菌最新研究进展.微生物学杂志,36(2):87-92.2.O.N.Reva,C.Dixelius,etal.2004.TaxonomiccharacterizationandplantcolonizingabilitiesofsomebacteriarelatedtoBacillusamyloliquefaciensandBacillussubtilis.FEMSMicrobialEcology,48:249-259.3.范青,田世平,等.2001.采摘后果实病害生物防治拮抗菌的筛选和分离.中国环境科学,21(4):313-316.4.X.H.Chen,A.Koumoutsi,R.Scholz,etal.2007.Comparativeanalysisofthecompletegenomesequenceoftheplantgrowth-promotingbacteriumBacillusamyloliquefaciensFZB42.NatureBiotechnology,25(9):1007-1014.
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种生防用解淀粉芽孢杆菌菌剂及其制备方法和具体应用。本专利技术公开了一种生防用解淀粉芽孢杆菌菌株，保藏名称为解淀粉芽孢杆菌B4(BacillusamyloliquefaciensB4)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所,邮编100101，保藏号为CGMCCNo:13466，保藏日期为2016年12月19日。生防用解淀粉芽孢杆菌菌株经16srDNA鉴定，为BacillusamyloliquefaciensB4。所述菌株的单菌落为圆形、白色、边缘粗糙、不透明、表面略褶皱。菌株在需氧性试验结果为沿培养基表面生长，为好氧菌。根据所绘的生防用解淀粉芽孢杆菌菌株生长曲线，解淀粉芽孢杆菌在培养4h后进入对数期，12h后逐渐进入稳定期。所述的生防用解淀粉芽孢杆菌菌株可以用于制备防治水果(如梨、苹果、枇杷、樱桃番茄)采后腐败的芽孢杆菌菌剂。针对不同水果，水晶梨、樱桃番茄、枇杷、苹果的采后保鲜，优选的采用含有活性成分的芽孢杆菌菌剂，活性成分分别是解淀粉芽孢杆菌的发酵液、上清液、菌悬液。含有解淀粉芽孢杆菌的发酵液和菌悬液的生物保鲜剂的成分为，每毫升生物保鲜剂中含有解淀粉芽孢杆菌107-1010个，其余分别是培养基和生理盐水。含有解淀粉芽孢杆菌的上清液的生物保鲜剂的成分为在发酵液的基础上膜过滤除菌即可。更加优选的，解淀粉芽孢杆菌的发酵液对苹果、水晶梨、樱桃番茄、枇杷的采后腐败均有防治效果。解淀粉芽孢杆菌的菌悬液对水晶梨、苹果、枇杷的采后腐败有防治效果。解淀粉芽孢杆菌的上清液对樱桃番茄、水晶梨的采后腐败有防治效果。各活性成分的制备过程如下：1)解淀粉芽孢杆菌菌种在LB培养基上生长，其培养基配方为胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L、琼脂20g/L，用0.1mol/L的NaOH调节pH7.4，在121℃下灭菌20min。2)挑取1)中适量的解淀粉芽孢杆菌加入到含有50mLLB液体培养基的锥形瓶中，放置在37℃，转速为150rpm的摇床中振荡培养12-16h，然后在超净台稀释6-7倍，每个浓度取200μL菌液涂布到LB固体培养基中。3)根据2)中测得的菌落数，将解淀粉芽孢杆菌的浓度稀释到1×107-1×1010CFU/mL，即得到芽孢杆菌发酵液。4)根据(3)中所得的发酵液，在4000g的条件下离心5min，过0.22μm无机滤膜，将上清液和沉淀分离。上清液即是芽孢杆菌上清液保鲜剂。在装有沉淀中离心管中加入等体积的无菌生理盐水，振荡均匀，再次离心洗脱，所得的菌悬液即是解淀粉芽孢杆菌的菌悬液保鲜剂。本专利技术的解淀粉芽孢杆菌菌悬液和发酵液保鲜剂因含解淀粉芽孢杆菌，需在常温或者低温下储藏。本专利技术施用的保鲜剂有效利用了解淀粉芽孢杆菌的不同活性成分，从而使不同水果(如枇杷、水晶梨、樱桃番茄、苹果)的采后病害的发生得到了有效抑制。本专利技术的生物保鲜剂具有安全高效的特点，对环境友好，生防用效果突出，能大大降低化学杀菌剂的使用，对发展绿色农业，维护食品安全，保证社会可持续发展都有重要的意义。附图说明图1解淀粉芽孢杆菌的生长曲线；图2生防用解淀粉芽孢杆菌B4与相似菌株16SrDNA序列的NJ系统发育树；图3枇杷、水晶梨、苹果的病斑直径和樱桃番茄的发病率。具体实施方式下面具体介绍含不同活性成分的解淀粉芽孢杆菌制剂防治常见水果采后腐败的方法。(一)解淀粉芽孢杆菌对扩展青霉在PDA平板上的抑制效应：1.生防用解淀粉芽孢杆菌BacillusamyloliquefaciensB4，其鉴定结果如图1，具有较好的体外抗青霉活性。2.一株生防用解淀粉芽孢杆菌发酵液、菌悬液、上清液的制备1)活化：将生防用解淀粉芽孢杆菌在LB培养基中37℃培养10h。然后重复传代培养2次，待用。2)发酵液制备和浓度确定：用接种环挑取适量菌于盛有50mLLB液体培养基的250mL锥形瓶，在150rpm，37℃的摇床中振荡本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种生防用解淀粉芽孢杆菌菌株，其特征在于：保藏名称为解淀粉芽孢杆菌B4(Bacillus amyloliquefaciens B4)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No:13466，保藏日期为2016年12月19日。

【技术特征摘要】
1.一种生防用解淀粉芽孢杆菌菌株，其特征在于：保藏名称为解淀粉芽孢杆菌B4(BacillusamyloliquefaciensB4)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo:13466，保藏日期为2016年12月19日。2.根据权利要求1所述的生防用解淀粉芽孢杆菌菌株，其特征在于：所述菌株的单菌落为圆形、白色、不透明、菌株为好氧菌。3.根据权利要求1所述的生防用解淀粉芽孢杆菌菌株，其特征在于所述菌株在培养4h后进入对数期，12h后逐渐进入稳定期。4.一种生防用解淀粉芽孢杆菌菌剂，其特征在于包含以下(a)、(b)、(c)三种活性成分中的至少一种：(a)权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌的上清液；(b)权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌的菌悬液；(c)权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌的发酵液。5.根据权利要求4所述的菌剂，其特征在于所述活性成分的制备方法具体为：1)解淀粉芽孢杆菌菌种在LB培养基上生长，挑取适量的解淀粉芽孢杆菌加入到含有50mLLB液体培养基的锥形瓶中，放置在37℃、转速为150rpm的摇床中振...

【专利技术属性】
技术研发人员：周文文，孙亚芳，郑晓冬，蒋晶，汤曦，汪旖清，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33