本发明专利技术提供了水稻转化受体来源的外源转基因的检测方法。属于生物技术领域。具体为在来源于转化受体的野生型基因中引入若干SNP位点，但不改变氨基酸序列，将修饰后的基因克隆于表达载体并转化水稻，从而获得转基因水稻。而后可利用SNP位点来区别转基因植株中相同等位基因的外源性与内源性。本方法可以应用于转基因水稻回交转育材料中外源基因的检测，也可应用于与标记基因分离后转基因植株中外源基因的检测。该发明专利技术不仅可以区分转基因水稻中外源与相应的内源基因，而且可以判断该位点的纯合或杂合状态。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
具体为在来源于植物的野生型基因中引入若干SNP位点，将修饰后的该基因克隆于表达载体并转化水稻，从而获得转基因植物。而后可利用SNP 位点来区别转基因植物中相同等位基因的外源性与内源性。
技术介绍
转基因技术已成为目前发展最迅猛的现代技术之一。从1996年的170万公顷到 2009年的1. 34亿公顷，转基因作物在13年间耕种面积增长了 80倍(Clive James, 2009)。 转基因技术广泛发展和利用的同时，各国及国际社会也在不断加强其生物安全评价研究与实施，例如在1992年召开的联合国环境与发展大会签署了两个纲领性文件——《21世纪议程》和《生物多样性公约》，并于2000年经多国签署了《卡塔赫纳生物安全议定书》。转基因植物生物安全评价的内容之一是对目标转基因进行分子生物学检测及跟踪。所以针对目标基因序列进行PCR扩增、测序或Southern blot可以有效地检测外源基因。随着对安全性要求的提高，为了有效降低转基因对环境及食品带来的风险，并提高消费者的接受程度，越来越多的研究及专利技术开始利用植物来源的甚至受体植物自身来源的外源基因来改良作物以增加产量、改良品质，提高非生物及生物胁迫能力。但是，由于转基因来源于受体，即受体本身含有该基因，因此利用常规方法难于鉴别内源和外源基因。另一方面，出于食品安全性的考虑，无标记基因转化系统发展迅速。常用基因如糖类分解代谢酶基因(Pawan K J, 2002)、β -葡萄糖苷酸酶基因(Pawan K J, 2002)、绿/ 黄/红色荧光蛋白基因(Pawan K J, 2002)、叶绿素合成酶基因(Cough K C, 2001)、化合物解毒酶基因(Daniel H, 2001; Scott P B, 2003)及天门冬氨酸激酶基因(Pawan K J, 2002)等。剔除标记基因的机制主要为同源重组或在分离世代选择无标记的个体。农杆菌介导的双T-DNA转化方法是将目标基因与筛选标记基因分别克隆在两个T-DNA上用来转化外殖体，基因枪共转化法是用两个以上质粒/DNA片段同时轰击转化外植体，两者目的均是在转基因植株后代有性繁殖过程中经遗传重组及人工选择将携带标记基因的植株剔除，从而筛选出无选择标记基因的转基因植株后代。但当外源基因是供体来源的基因时，剔除标记基因后的转基因植株中的目标基因将难以进行分子检测及跟踪。此外，将野生型等位基因转化植物突变体后，在转化植株及其自交后代中可利用引起功能变化的序列差异鉴定外源基因，如PCR检测。但是，当将转化事件通过有性杂交转育至其它野生型遗传背景中后，由于野生型遗传背景含有该转基因对应的内源基因，因此无法区分植物基因组本身的内源基因与导入的外源基因。迅猛发展的第三代分子标记单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism, SNP)标记技记术是一种高通量、低成本、可机械操作的分型方法，为解决上述多种问题提供了技术依据。高通量快速检测平台的建立使其应用更加广泛。与SSR分子标记相比，以Taqman real-time PCR为基础的SNP检测平台可使用384孔板一次检测1 百万个样品，真正达到高通量、低成本(Guptaet al. 2008)。如果在转化植物之前向目标3基因内部引入SNP标记，利用Taqman real-time PCR技术对转基因植株及其后代进行检测，不仅能区分转化植株中内、外源基因，还可区分目标基因的纯合及杂合状态。
技术实现思路
本专利技术解决了植物转化受体来源的外源转基因的检测问题，属于生物
具体为在来源于转化受体的野生型基因中引入若干SNP位点，但不改变所编码氨基酸序列，然后将修饰后的该基因克隆于表达载体并转化植物，从而获得转基因植物。而后可利用 SNP位点来区别转基因植株中相同等位基因的外源性与内源性。本方法可以应用于回交转育材料中外源基因的检测，也可应用于与标记基因分离后转基因植株中外源基因的检测。本专利技术依次通过下列步骤实现1.设计并合成含有目标位点突变的引物，对目标基因进行PCR扩增，在不改变氨基酸序列的同时向目标基因引入SNP位点。2.将含有SNP突变位点的目标基因构建至表达载体。3.用上述转化载体转化受体植物。4.利用Real-Time PCR方法(TaqMan探针)检测转基因植物中目标基因中的SNP 位点。5.将上述转基因植株中转化事件通过有性杂交转育至其它背景中，利用 Real-Time PCR仪器结合TaqMan探针法检测新育成品系/种中目标基因中的SNP位点，并判断该位点的纯合或杂合状态。本专利技术方法所涉及的引物合成技术、植物叶片总DNA提取技术、PCR技术、载体构建技术、Southern blot技术、植物遗传转化技术以及利用Real-Time PCR仪器进行的SNP 检测技术(TaqMan探针)均为公知技术。筛选/标记基因即红色荧光蛋白基因的编码序列可在NCBI数据库中查阅。本专利技术的优点是1.与SSR等第二代分子标记相比，本专利技术利用的SNP标记是一种高通量、低成本、可机械操作的分型方法。使用针对核酸中不同多态性序列的荧光Taqman探针，它们在PCR扩增中被水解释放荧光信号，只有与靶序列完全匹配的探针才能被相应的切割。利用多通道 real-time PCR仪检测结果，可以便捷地判断核酸多态性。以hqman real-time PCR为基础的SNP检测平台可使用384孔板一次检测1百万个样品。在转化植物之前向目标基因内部引入SNP标记，可以便捷地检测、区分转化植株中内、外源基因。2.当外源基因是供体来源的基因时，可使用本专利技术检测并跟踪剔除标记基因后的转基因植株中的外源目标基因。3.转化受体来源的野生型基因转化植物后，可用本专利技术检测外源基因的存在与否。将转基因通过有性杂交转育至野生型遗传背景中后，可以使用本专利技术检测外源基因是否存在并加以跟踪。附图说明图IA显示了实施例1中的不育系水稻植株花器官形态学观察示意图。图IB显示了实施例1中的不育系水稻植株上不能形成正常花粉。图2显示了实施例1中5^激缺失片段及引物位置示意图。图3显示了实施例4中经农杆菌转化后获得的荧光愈伤组织。图4显示了实施例4中经农杆菌转化后获得的再生植株。图5显示了实施例5中部分转基因植株的Southern blot鉴定(N 阴性对照，Marker: 分子量标准；P 以转化质粒作为阳性对照)。图6显示了实施例6中转基因苗SNP检测结果。图中圆点表示FAM荧光检测(含 SNP位点，纯合)；三角型表示VIC荧光检测(不含SNP位点)；正方型表示FAM和VIC同时检测(含SNP位点，杂合)；差号表示不能判断。具体实施例方式下文结合实施例和附图具体描述本专利技术的技术方案，但不限于此。实施例1 遗传转化材料的创制利用化学诱变的方法处理野生型水稻品种武运粳7号，创制水稻突变体库，从中筛选水稻核隐性雄性不育突变体 sl，该突变体在突变位点处于纯合状态。突变的水稻植株不能形成花粉。附图IA显示了水稻核隐性不育突变体5^激植株稻穗及花器官形态学表现。 附图IB显示了水稻突变体植株上不能形成花粉。与野生型等位基因1 相比，突变等位基因rns激缺失了 3102个碱基。利本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种有效的辨别转基因水稻中内源ＭＳ２６基因和相对应外源ＭＳ２６基因的方法，该方法包括以下步骤：ａ） 构建水稻核隐性雄性不育突变体，ｂ） 鉴定外源转基因的ＳＮＰ位点，ｃ） 检测并跟踪由含有１．１所述ＳＮＰ的转基因水稻与其它水稻品种／系杂交后代中的ＳＮＰ。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：邓兴旺，王海洋，万向元，周君莉，
申请(专利权)人：北京未名凯拓作物设计中心有限公司，北京凯拓迪恩生物技术研发中心有限责任公司，
类型：发明
国别省市：11
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。