本发明专利技术涉及中药材基原植物物种鉴定技术领域，具体涉及利用核糖体DNA的ITS2片段鉴别畲药食凉茶及其近缘易混种的方法及应用。DNA条形码鉴别畲药食凉茶基原物种及其近缘易混种的方法，该方法包括1）DNA样品提取；2）PCR扩增含有ITS2序列的片段；3）PCR扩增产物的拼接；4）多个物种ITS2序列的比对；5）基于ITS2序列构建系统进化树。本发明专利技术提供的食凉茶基原物种及其近缘易混种DNA提取方法和ITS2制备方法可以有效解决食凉茶及其近缘种的物种鉴定以及种质资源的开发利用等问题。本发明专利技术方法适用性广，操作简易，易于掌握，准确性高。能够成功实现对食凉茶基原物种及其近缘易混种的快速、准确鉴定。
【技术实现步骤摘要】
DNA条形码鉴别畲药食凉茶基原物种及其近缘易混种的方法
本专利技术涉及中药材基原植物物种鉴定
，具体涉及利用核糖体DNA的ITS2片段鉴别畲药食凉茶及其近缘易混种的方法及应用。
技术介绍
畲医药是祖国医药学宝库中的一个重要组成部分，也是世界优秀文化遗产的一部分，是畲族人民在特定的历史条件下和特殊的地理环境中，为求生存与繁衍，长期与疾病作斗争的过程中总结经年累月防病治病的经验，逐步形成的具有民族特色的医药。作为畲族特有药材，食凉茶在民间使用历史悠久，其基原物种为蜡梅属植物柳叶蜡梅(ChimonanthussalicifoliusHu)或浙江蜡梅(ChimonanthuszhejiangensisM.C.Liu)的干燥叶，是畲族应用最广的药材之一。蜡梅属植物为我国特产，分布在浙江、福建、江西等地，日本、朝鲜、欧洲、北美等地也有引种栽培。食凉茶被2005年版《浙江省中药炮制规范》作为常用畲药收载，而且是以畲民俗称首次收载的新品种[5]。研究资料表明，食凉茶中主要含有挥发油、黄酮等，可用来治疗伤风感冒、脾虚食滞、脘痛吞酸等常见病。在药理和临床应用方面，发现食凉茶有抑菌抗炎、解热镇痛、镇咳祛痰等作用，对咽喉炎有显著疗效，对气管炎、高血压也有一定的疗效。食凉茶使用历史悠久、疗效确切、副作用较少，是值得研究开发的药茶多用品种。蜡梅属植物形态非常接近，传统形态鉴定比较困难，导致蜡梅属植物的系统分类、起源和进化都存在争议，因此在实际生产和临床应用中误用、混用近缘易混种现象时有发生。目前，关于食凉茶的研究多数集中在药理、化学成分等方面，但对于其基原物种的鉴定研究甚少，仅竺叶青等从传统形态学方面对腊梅属植物进行了系统分类、鉴定，未见有利用现代分子生物学技术进行物种鉴定。由于食凉茶基原物种的化学成分以及药理作用与蜡梅属其他物种如：蜡梅(Chimonanthuspraecox(L.)Link)、山蜡梅(ChimonanthusnitensOliv.)、西南蜡梅(ChimonanthuscampanulatusR.H.ChangetC.S.Ding)和夏蜡梅属美国蜡梅(CalycanthusfloridusL.)、夏蜡梅(CalycanthuschinensisChengetS.Y.)存在明显差异，混用乱用严重影响了食凉茶的临床疗效与用药安全，因此对其进行准确鉴定显得尤为重要。随着分子生物学技术和生物信息学的发展，基于DNA条形码技术进行鉴定和分类的研究已成为生物分类学研究中引人注目的新方向和研究热点。DNA条形码技术是利用一段或几段标准DNA序列作为标记来实现快速、准确和自动化的物种鉴定，类似于超市利用条形码扫描区分成千上万种不同的商品。DNA条形码已经成为生态学研究的重要工具，不仅用于物种鉴定，同时也帮助生物学家进一步了解生态系统内发生的相互作用。本文利用DNA条形码技术，基于ITS2序列对食凉茶基原物种及其近缘种进行准确鉴别，确保蜡梅属药材临床用药的准确性和安全性，为畲医畲药的开发与研究提供技术保障。
技术实现思路
本专利技术目的是提供利用核糖体DNA的ITS2片段鉴别食凉茶基原物种及其近缘易混种的方法。为了实现上述的目的，本专利技术采用了以下的技术方案：DNA条形码鉴别畲药食凉茶基原物种及其近缘易混种的方法，其该方法包括以下的步骤：1)提取食凉茶基原物种及其近缘易混种叶片的基因组DNA；2)以ITS2-F引物和ITS3-R为引物PCR扩增目的片段ITS2序列；所述ITS2-F引物的核苷酸序列如序列表SEQIDNo.1所示；所述ITS3-R引物的核苷酸序列如序列表SEQIDNo.2所示；3)对PCR扩增所得的ITS2序列进行检测，测序，拼接；4)基于K2P模型，构建测序拼接后的ITS2序列的系统发育树，以ITS2序列作为条形码鉴别食凉茶基原植物及其近缘种。作为优选，步骤1)中所述食凉茶基原物种及其近缘易混种DNA提取方法为：采集食凉茶基原物种及其近缘易混种叶片，用75％乙醇擦洗叶片表面后晾干，后用变色硅胶干燥。取干燥叶片约20mg，用研磨仪研磨2min，30次/秒，后用植物DNA提取试剂盒提取总DNA，65℃水浴1h，其余步骤按照试剂盒说明书进行。作为优选，步骤2)中所述PCR扩增反应体条件为：正向引物：SEQIDNo.1：5′-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3′；反向引物：SEQIDNo.2：5′-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3′；反应体系：2×TaqMixMaster12.5μL、正反向引物，2.5μM，各1.0μL、总DNA2μL，加灭菌ddH2O补至25μL；反应程序：94℃，5min；94℃30s，56℃30s，72℃45s，40个循环；72℃10min。作为优选，步骤3)中所述的ITS2序列进行检测方法为：采用琼脂糖凝胶电泳方法检测PCR产物，电泳后，PCR产物在相应的DNA条形码序列长度位置出现清晰的目的条带，阴性对照无对应条带，将PCR产物送测序公司进行DNA测序，PCR引物作为测序引物，测序结果采用Oligo6软件进行拼接。作为优选，食凉茶基原物种为柳叶蜡梅和浙江蜡梅中的一种，近缘易混种为蜡梅、山蜡梅、西南蜡梅、美国蜡梅和夏蜡梅中的一种。作为优选，柳叶蜡梅ITS2序列长度为256～258bp，有3个单倍型，序列详见SEQIDNo.3，SEQIDNo.4和SEQIDNo.5；浙江蜡梅ITS2序列长度均为256bp，有2个单倍型序列详见SEQIDNo.6和SEQIDNo.7；蜡梅、山腊梅、西南蜡梅、夏蜡梅和美国蜡梅ITS2序列长度为256-260bp，只检测到一个单倍型，序列详见SEQIDNo.8，SEQIDNo.9，SEQIDNo.10，SEQIDNo.11和SEQIDNo.12。本专利技术提供的食凉茶基原物种及其近缘易混种DNA提取方法和ITS2制备方法可以有效解决食凉茶及其近缘种的物种鉴定以及种质资源的开发利用等问题。本专利技术方法适用性广，操作简易，易于掌握，准确性高。能够成功实现对食凉茶基原物种及其近缘易混种的快速、准确鉴定。附图说明图1食凉茶基原植物及其近缘种种间序列比对(拉丁名后字母为单倍型编号)。图2基于ITS2序列的食凉茶基原植物及其近缘易混种的NJ树(拉丁名后为单倍型编号，Bootstrap1000次重复)。图3食凉茶基原植物及其同属近缘种种间序列比对(拉丁名后字母为单倍型编号)。图4基于ITS2序列的食凉茶基原植物及其同属易混种的NJ树(拉丁名后为单倍型编号，Bootstrap1000次重复)。具体实施方式以下参照具体的实施例来说明本专利技术。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。实施例1鉴别食凉茶基原植物及蜡梅属、夏蜡梅属易混种1提供样本收集不同产地的食凉茶基源植物和同属易混种叶片样本共37份(详见表1)表1样品信息表2基因组DNA提取将表1中叶片样品用变色硅胶干燥，取叶片约20mg，用研磨仪RetschMM400,Germany)研磨2min(30次/秒)后用植物DNA提取试剂盒(TiangenBiotechCo.,China)提取总DNA，65℃水浴1h，其余步骤按照试剂盒说明书进行。3本文档来自技高网...
【技术保护点】
DNA条形码鉴别畲药食凉茶基原物种及其近缘易混种的方法，其特征在于该方法包括以下的步骤：1）提取食凉茶基原物种及其近缘易混种叶片的基因组DNA；2）以ITS2‑F引物和ITS3‑R为引物PCR扩增目的片段ITS2序列；所述ITS2‑F引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1所示；所述ITS3‑R引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.2所示；3）对PCR扩增所得的ITS2序列进行检测，测序，拼接；4）基于K2P模型，构建测序拼接后的ITS2序列的系统发育树，以ITS2序列作为条形码鉴别食凉茶基原植物及其近缘种。
【技术特征摘要】
1.DNA条形码鉴别畲药食凉茶基原物种及其近缘易混种的方法，其特征在于该方法包括以下的步骤：1）提取食凉茶基原物种及其近缘易混种叶片的基因组DNA；2）以ITS2-F引物和ITS3-R为引物PCR扩增目的片段ITS2序列；所述ITS2-F引物的核苷酸序列如序列表SEQIDNo.1所示；所述ITS3-R引物的核苷酸序列如序列表SEQIDNo.2所示；3）对PCR扩增所得的ITS2序列进行检测，测序，拼接；4）基于K2P模型，构建测序拼接后的ITS2序列的系统发育树，以ITS2序列作为条形码鉴别食凉茶基原植物及其近缘种。2.根据权利要求1所述的DNA条形码鉴别畲药食凉茶基原物种及其近缘易混种的方法，其特征在于步骤1）中所述食凉茶基原物种及其近缘易混种DNA提取方法为：采集食凉茶基原物种及其近缘易混种叶片，用75%乙醇擦洗叶片表面后晾干，后用变色硅胶干燥；取干燥叶片约20mg，用研磨仪研磨2min，30次/秒，后用植物DNA提取试剂盒提取总DNA，65℃水浴1h，其余步骤按照试剂盒说明书进行。3.根据权利要求1所述的DNA条形码鉴别畲药食凉茶基原物种及其近缘易混种的方法，其特征在于步骤2）中所述PCR扩增反应体条件为：正向引物：SEQIDNo.1：5′-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3′；反向引物：SEQIDNo.2：5′-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3′；反应体系：2×TaqMixMaster12.5μL、正反向引物，2.5μ...
【专利技术属性】
技术研发人员：吕群丹，程科军，姚辉，马双姣，程文亮，方洁，徐金标，姜程曦，周红，
申请(专利权)人：丽水市农业科学研究院，中国医学科学院药用植物研究所，
类型：发明
国别省市：浙江,33
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