一种诱导成熟细胞去分化的方法技术

本发明专利技术公开了一种诱导成熟细胞去分化的方法。本发明专利技术提供的诱导成熟细胞去分化的方法，包括如下步骤：将成熟细胞在固体培养基中进行培养，得到球状细胞，所述球状细胞具有胚胎干细胞全能性；所述固体培养基为将2×DMEM基础培养基与凝固剂混合，得到固体培养基。本发明专利技术的实验证明，本发明专利技术将具有分化功能的HEK293细胞通过低贴附表面的培养方法，人胚胎肾上皮细胞系HEK293以三维立体球状生长，实验结果表明三维球状培养的HEK293细胞发生了去分化，获得了胚胎干细胞和肾脏前体细胞的特性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及 生物
，尤其涉及。
技术介绍
去分化是指将已分化的细胞类型转化为另一较原始的具备更多分化潜能的细胞类型，如类似胚胎干细胞或前体细胞的状态。去分化的研究对于细胞生物学的科学研究和干细胞的临床应用方面都具有重要意义。目前去分化研究主要采取转基因的方法，但是由于基因组的改变，细胞面临癌变的风险。细胞命运不仅受内部基因的调控，外部环境的影响也是很关键的，如能通过物理手段调控细胞微环境实现细胞去分化将避免转基因去分化所带来的细胞癌变风险。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供。本专利技术提供的方法，包括如下步骤:将成熟细胞在哺乳动物细胞固体培养基中进行培养，得到球状细胞，实现诱导成熟细胞去分化；所述哺乳动物细胞固体培养基为将哺乳动物细胞液体培养基与凝固剂混合，得到固体培养基。上述方法中，所述哺乳动物细胞液体培养基可以根据培养的细胞不同进行选择，本专利技术培养HEK293细胞，因此选用的哺乳动物细胞液体培养基为2 X DMEM基础液体培养基;所述凝固剂为琼脂糖；凝固剂的加入量只要凝固即可，本专利技术的实施例为等体积的2 X DMEM基础培养基和1%琼脂糖溶液混匀。所述琼脂糖为质量百分含量为1%琼脂糖水溶液；所述2 X DMEM基础液体培养基与质量百分含量为1%琼脂糖水溶液混合体积比为1:1。上述方法中，所述培养为将所述成熟细胞接种到装有所述哺乳动物细胞固体培养基的培养容器上进行培养；所述培养的条件如下:在37°C、5%C02培养。上述方法中，所述培养的时间为5-10天；所述培养容器为培养皿；所述成熟细胞与所述固体培养基的配比为106-6X IO6个/5ml。上述方法中，所述成熟细胞为HEK293细胞。上述方法中，所述球状细胞具有胚胎干细胞全能性，但不是人胚胎干细胞；所述胚胎干细胞全能性具体体现在如下I)_5)中至少一种:1)提高iPS重编程转录因子的相对表达量；所述iPS重编程转录因子具体为0CT4、NANOG, S0X2、KLF4和/或LIN28 ；2)提闻胚胎干细胞标志物的相对表达量；所述胚胎干细胞标志物具体为REX1、TDGF1、LEFTB、EBAF、GRB7、PODXL和/或FGF4 ；3)提高三胚层标志物的相对表达量；所述三胚层标志物为内胚层标志物FoxA2、Afp、Soxl7和Pdx-1中的至少一种、中胚层标志物Brachyury、Msxl中的至少一种和/或外胚层标志物Nestin、0tx2和Tp63中的至少一种；4)提高细胞成瘤能力；5)提高肾脏组织前体标志物相对表达量。所述肾脏组织前体标志物为ΡΑΧ2、WTl、INTEGRINa8、SALLl、LIMU NCAMl、SIX2、FRIZZLED 2、FRIZZLED 7、ACVR2b/ 或 NTRK2。由上述方法得到的球状细胞也是本专利技术保护的范围。上述球状细胞具有胚胎干细胞全能性，但不是人胚胎干细胞；所述胚胎干细胞全能性具体体现在如下I) _5)中至少一种:I)提高iPS重编程转录因子的相对表达量；2)提高胚胎干细胞标志物的相对表达量；3)提高三胚层标志物 的相对表达量；4)提高细胞成瘤能力；5)提高肾脏组织前体标志物相对表达量。本专利技术的实验证明，本专利技术将具有分化功能的HEK293细胞通过低贴附表面的培养方法，人胚胎肾上皮细胞系HEK293以三维立体球状生长，实验结果表明三维球状培养的HEK293细胞发生了去分化，获得了胚胎干细胞和肾脏前体细胞的特性。附图说明图1为细胞在二维贴壁培养皿和在低贴附培养皿上培养结果图2为细胞在二维培养和低贴附培养后iPS重编程转录因子和胚胎干细胞标志物的相对表达量图3为细胞在二维培养和低贴附培养后内胚层标志物、中胚层标志物和外胚层标志物的相对表达量图4为细胞在二维培养和低贴附培养后致瘤能力图5为细胞在二维培养和低贴附培养后肾组织前体细胞标志物的相对表达量具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、诱导成熟细胞发生去分化形成具有干细胞功能细胞一、诱导成熟细胞发生去分化形成具有干细胞功能细胞方法1、低贴附培养皿的制备配制2 X DMEM基础液体培养基:将13.4g高糖培养基粉末(Gibco)和3.7g碳酸氢钠用500ml去离子水溶解，0.22 μ滤膜过滤除菌，得到2XDMEM基础培养基。上述高糖培养基粉末购自Gibco。2XDMEM基础液体培养基也可以按照如下配置:用水将下述物质溶解成如下浓度，并补足体积为IL:无水氯化钙(2Η20) 265.00mg/L、L-丝氨酸42.00mg/L、硝酸铁(9H20)0.10mg/L、L-苏氨酸 95.00mg/L、氯化钾 400.00mg/L、20L_ 色氨酸 16.00mg/L、无水硫酸镁 97.67mg/L、L-酪氨酸 72.00mg/L、氯化钠 6400.00mg/L、L-缬氨酸 94.00mg/L、无水磷酸二氢钠 109.00mg/L、D-泛酸韩 4.00mg/L、丁二酸 75.00mg/L、酒石酸胆碱 7.20mg/L、丁二酸钠 100.00mg/L、叶酸 4.00mg/L、L-盐酸精氨酸 84.00mg/L、肌醇 7.20mg/L、L-盐酸胱氨酸63.00mg/L、烟酰胺4.00mg/L、甘氨酸30.00mg/L、核黄素0.40mg/L、L-盐酸组氨酸42.00mg/L、盐酸硫胺4.00mg/L、L_异亮氨酸105.00mg/L、盐酸吡哆辛4.00mg/L、L_亮氨酸105.00mg/L、葡萄糖 1000.00mg/L、L_ 盐酸赖氨酸 146.00mg/L、丙酮酸钠 110.00mg/L、L-甲硫氨酸30.00mg/L、酹红9.30.00mg/L、L-苯丙氨酸66.00mg/L和碳酸氢钠7.4g/L。低贴附培养基皿的制备:将2XDMEM基础培养基预热至37° C，然后配制1%琼脂糖溶液。将等体积的2 X DMEM基础培养基和1%琼脂糖溶液混匀，倒入60mm petridish, 5ml/dish。随着温度下降，2 XDMEM基础液体培养基和1%琼脂糖溶液混合物会凝成胶状，附着在培养皿底部，形成低贴附的表面，得到装有低贴附固体培养基的低贴附培养基皿。二维贴壁培养皿的制备:将含有10% (质量百分含量)血清(Gibco)的DMEM培养基(Gibco)预热至37° C，然后配制1%琼脂糖溶液。将等体积的含有10% (质量百分含量)血清(Gibco)的DMEM培养基(Gibco)和1%琼脂糖溶液混勻，倒入60mm petri dish, 5ml/dish。随着温度下降，含有10% (质量百分含量)血清(Gibco)的DMEM培养基(Gibco)和1%琼脂糖溶液混合物会凝成胶状，附着在培养皿底部，形成二维贴壁培养皿。 2、诱导成熟细胞发生去分化形成具有干细胞功能细胞成熟细胞为HEK293细胞，购自北京协和细胞中心，HEK293细胞源自人胚胎肾上皮，认为是终端分化的细胞，不具有干细胞的分化能力。将诱导成熟细胞发生去分化形成具有干细胞功能细胞采用成球培养，并以常规的单层细胞培养为对照。成球培养组:采用如下的低贴附的培养:将HEK293细胞按照每6 X IO6个细胞接种到低本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种诱导成熟细胞去分化的方法，包括如下步骤：将成熟细胞在哺乳动物细胞固体培养基中进行培养，得到球状细胞，实现诱导成熟细胞去分化；所述哺乳动物细胞固体培养基为将哺乳动物细胞液体培养基与凝固剂混合，得到固体培养基。

【技术特征摘要】
1.一种诱导成熟细胞去分化的方法，包括如下步骤:将成熟细胞在哺乳动物细胞固体培养基中进行培养，得到球状细胞，实现诱导成熟细胞去分化； 所述哺乳动物细胞固体培养基为将哺乳动物细胞液体培养基与凝固剂混合，得到固体培养基。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述凝固剂为琼脂糖。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于:所述培养为将所述成熟细胞接种到装有所述固体培养基的培养容器上进行培养； 所述培养的条件具体如下:在37°C、5%C02培养。4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于:所述培养的时间为5-10天；所述培养容器为培养皿。5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于:所述成熟细胞与所述哺乳动物细胞固体培养基的配比为106-6X 106个/5ml。6.根据权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：苏冠男，赵燕南，魏建树，陈冰，肖志峰，戴建武，
申请(专利权)人：中国科学院遗传与发育生物学研究所，
类型：发明
国别省市：