本发明专利技术属生物医学领域，涉及一种诱导胎盘间充质干细胞分化为胰岛样细胞的方法，具体涉及三七总皂甙诱导胎盘间充质干细胞分化为胰岛样细胞的方法；所述的方法中，将获得离体人胎盘组织，消化获得单细胞悬液后，进行贴壁细胞培养，获得间充质干细胞，然后用不同浓度的三七总皂甙诱导细胞培养基诱导分化所述的间充质干细胞，获得胰岛样细胞。本发明专利技术选用离体人胎盘间充质干细胞，提供合适的诱导方案，诱导其向胰岛样细胞分化，并能取得足够存活量和存活期，为糖尿病细胞治疗提供理想的种子细胞，为糖尿病细胞移植治疗将提供新途径，具有广阔的临床应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属生物医学领域，涉及诱导干细胞分化为胰岛样细胞的方法，具体涉及，尤其涉及用三七总皂甙诱导胎盘间充质干细胞分化为胰岛样细胞的方法。
技术介绍
据报道，近年来糖尿病的发病率激增，该病已成为危害人类健康的主要杀手。而传统的治疗方法却仍不能有效而稳定地控制血糖，因此，研究者试图改进糖尿病的治疗方法，转而将关注点转向胰岛细胞移植。但是，该疗法却因细胞来源匾乏而受到限制。面对细胞来源的巨大缺口，目前较有希望的是从干细胞诱导分化出大量可供移植的胰岛样细胞。己有研究报道指出，胚胎干细胞、多种成体干细胞均可被诱导分化为胰岛样细胞；但这方面的 研究还处于起步阶段，远未能应用于临床治疗，且尚存在诸多缺陷，如胚胎干细胞的应用受到伦理学、致瘤性的限制，而成体干细胞则分化潜能较弱，分化能力受到多种因素制约，且部分成体干细胞在取材、体外培养扩增方面均存在困难。有研究表明，胎盘间充质干细胞易于获取，体外增殖分化能力强，是非常有前途的细胞来源件。从发育的角度来说，胎盘间充质干细胞较其他成体千细胞原始，其能表达部分胚胎时期的标志物；作为“医疗废弃物”，其来源广泛，且不受伦理学的限制。胎盘间充质干细胞具有较强的增殖能力，可向三个胚层的组织细胞分化。有研究进行了一些由胎盘干细胞向胰岛样细胞的科研尝试，其中仍存在许多问题亟需解决(I)干细胞分化为胰岛样细胞，受干扰因素非常多，且存活率不理想，因此，学术界期望找到合适的诱导剂和条件以保证干细胞沿预期方向分化、增殖，并取得足够存活量和存活期；目前的研究发现，西药的诱导力度稳定，如最常用的￠-巯基乙醇，但其毒性往往令人望而却步，不能作为诱导剂，以保证干细胞沿预期方向分化、增殖；(2)诱导分化的细胞胰岛素分泌效率低，据目前文献报道，利用诱导因子合用的方法诱导的胰岛样细胞胰岛素分泌的浓度为226. OmU/L,并不理想。近年来，有关中药单体成分对干细胞分化的影响研究所取得的成就已为业界公认，如三七总皂甙、丹参酮等。有研究显示，三七药物植物的化学成分较多，主要由四环三萜达玛烷型原人参二醇组皂甙和四环三萜达玛烷型原人参三醇组皂甙组成；三七总皂甙为三七植物中提取的有效物质，其具有良好的止血功效，能明显缩短出血和凝血时间，促进人体红细胞分裂、生长及明显补血功效，还能显著提高巨噬细胞吞噬率，提高血液中淋巴细胞比值，具有活血化瘀、祛瘀生新的疗效。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种诱导干细胞分化为胰岛样细胞的方法，具体涉及，尤其涉及用三七总皂甙诱导胎盘间充质干细胞分化为胰岛样细胞的方法。本专利技术中，所述的胎盘间充质干细胞来源于人的离体胎盘组织；获得的胎盘充质干细胞经分离、扩增和诱导分化过程制得胰岛样细胞。本专利技术的诱导胎盘间充质干细胞分化为胰岛样细胞的方法，从人离体胎盘组织分离出自免疫原性低、组织来源上较为原始的间充质干细胞，应用三七总皂甙诱导胎盘间充质干细胞分化为胰岛样细胞；本方法中所述的分化周期为通常为10-14天，经鉴定并测定胰岛素浓度，结果显示，所诱导、分化得到的细胞形态发生明显变化，其形态变圆且聚集成团，所述的细胞能分泌胰岛素，并对糖刺激具有反应。具体而言，本专利技术的诱导胎盘间充质干细胞分化为胰岛样细胞的方法，其特征在于，其包括步骤 (1)获得离体人胎盘组织，消化获得单细胞悬液； (2)贴壁细胞培养，获得间充质干细胞； (3)用不同浓度的三七总皂甙诱导细胞培养基诱导分化(2)的间充质干细胞， 所述不同浓度三七总皂甙分别为50-200mg/ml或300-800mg/ml ； (4)获得胰岛样细胞。本专利技术所述步骤(3)中，将步骤(2)获得的间充质干细胞，在含三七总皂甙50-200mg/ml, Activin A 4 y M，全反式维甲酸1004 U M条件下，诱导48小时后；在三七总皂甙50-200mg/ml，20nM孕酮和IOmM尼克酰胺，诱导48小时；然后，在三七总皂甙300-800mg/ml, 20ng/mL EGF, 10 nmol/L exendin-4 和 20 ng/ml HGF,诱导 6 天； 所述步骤(3)中，所述间充质干细胞诱导48小时后，优选转入高浓度三七总皂甙400-800mg/ml, 20ng/mL EGF, 10 nmol/L exendin-4, 20 ng/mlHGF 培养基中诱导 6 天。本专利技术中，所述的三七总皂甙诱导细胞培养基，通过下述方法制备 (1)准备试剂包括三七总皂甙、DMSO和含有5%胎牛血清的DMEM500ml ； (2)称量25 250mg三七总皂甙，溶解在100U I的DMSO中，移液器反复吹打搅混匀，避免出现三七总阜式不溶块和泡沫； (3)根据用量，用量简或移液管从中取出500ml含有和5%胎牛血清的DMEM培养基，将三七总皂甙加入培养基中，移液管混匀后分装，配制成有5(T500mg/L三七总皂甙诱导细胞培养基，置于4°冰箱保存备用； (4)培养基使用前置于37°C°水浴锅中预热后使用。本专利技术方法中，其特点在于，在诱导分化过程中的三个阶段分别应用不同浓度的三七总皂甙低浓度三七总皂甙50-200mg/ml，Activin A 4 y M，全反式维甲酸1004 y M诱导48小时培养细胞48小时；转入三七总皂甙50-200mg/ml，孕酮20nM，尼克酰胺IOmM诱导48小时；最后转入高浓度三七总皂甙300-800mg/ml，优选高浓度三七总皂甙400-800mg/ml, 20ng/mL EGF, 10 nmol/L exendin-4, 20 ng/mlHGF 培养基中诱导 6 天。本专利技术的一个实施例中，通过下述步骤，诱导胎盘间充质干细胞分化为胰岛样细胞 (I)分离胎盘间充质干细胞取离体的胎盘组织，PBS反复冲洗，剪碎，加入质量分数为0. 1%胶原酶，于37°C消化lh，过100目筛网，收集细胞悬液，室温下以1000r/min离心lOmin，弃上清；用含10%FBS的DMEM用12重悬细胞，制成单细胞悬液；接种到培养瓶中，置于37°C，5%C02，95%湿度的培养箱中孵育，3d后，第I次换液，去除未贴壁的细胞；(2)在含有20%胎牛血清DMEM间充质干细胞培养基中培养，隔天换液，3-4天传代后得到胎胎盘充质干细胞； (3)配制三七总皂甙诱导细胞培养基 所采用试剂包括三七总皂甙、DMSO和含有5%胎牛DMEM ； 称量三七总皂甙，溶解于100 ill的DMSO中，反复吹打搅混匀，避免出现三七总皂甙不溶块和泡沫；按需要量，用量筒或移液管从中取出500ml5% DMEM的培养基，将三七总皂甙加入培养基中，移液管混匀后分装，置于4°C冰箱保存备用；培养基使用前置于37°C°水浴锅中预热； (4)胎盘间充质干细胞在含有低浓度三七总皂甙50-200mg/ml，ActivinA 4yM，全反式维甲酸IOOii M 2%胎牛血清DMEM诱导48小时，转入含有三七总皂甙50-200mg/ml，孕酮 20nM，尼克酰胺IOmM 5%胎牛血清DMEM诱导48小时诱导，之后转入含有高浓度三七总皂甙 300-800mg/ml，20ng/mL EGF, 10 nmol/L exendin-4, 20 ng/mlHGF 5% 胎牛血清 DME本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种诱导胎盘间充质干细胞分化为胰岛样细胞的方法，其特征在于，其包括步骤：（1）获得离体人胎盘组织，消化获得单细胞悬液；（2）？贴壁细胞培养，获得间充质干细胞；（3）用不同浓度的三七总皂甙诱导细胞培养基诱导分化（2）的间充质干细胞，所述不同浓度三七总皂甙分别为50？200mg/ml或300？800mg/ml；（4）获得胰岛样细胞。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：莫朝晖，谢晓云，谢艳红，何红晖，金萍，陈科，赵立玲，
申请(专利权)人：中南大学湘雅三医院，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。