本发明专利技术提供了一种优化的CHK2 kinase Domain蛋白的分离纯化方法，所述CHK2 kinase Domain蛋白是CHK2截短至201位至531位氨基酸的片段，该方法中运用载体pGEX-6p-1和EcoRI、XhoI酶切位点以及BL21(DE3)表达纯化所述CHK2 kinase Domain蛋白，该方法中蛋白的纯化工艺流程简单，节约科研成本，蛋白的活性大幅度提高，并且能广泛应用于酶学，晶体学研究，以及高通量抑制剂筛选中。
【技术实现步骤摘要】
原核细胞中高效表达有活性的细胞周期检测点激酶2及其 分离纯化方法
本专利技术涉及一种重组蛋白酶，尤其涉及一种原核细胞中高效表达有活性的细胞周 期检测点激酶2的方法，属于重组蛋白酶领域。
技术介绍
癌症是威胁人民健康，危及人民生命的严重疾病，亦称恶性肿瘤（malignant neoplasm)，为由控制细胞生长增殖机制失常而引起的疾病。癌细胞除了生长失控外，还 会局部侵入周遭正常组织甚至经由体内循环系统或淋巴系统转移到身体其他部分。癌症 的治疗方法：手术治疗，放射治疗，化学疗法，靶向治疗等。肿瘤分子靶向治疗常用的治 疗靶点：细胞受体、信号传导和抗血管生成等。此类药物主要有两类，小分子化合物和单 克隆抗体，小分子化合物常用的有：Glivec (STI51，格列卫）、Iressa (ZD1839, Gefitinib， 易瑞沙）、Erlotinib (Tarceva，0SI-774,特罗凯）、Sorafenib (索拉非尼，多吉美）、 Sunitinib (Sutent，SUl 1248,舒尼替尼）、Lapatinib (拉帕替尼）、Vandetanib (凡德他 尼）、Dasatinib (达沙替尼）等；单抗类分子祀向药物常用的有：Herceptin (Trastuzumab, 贺赛汀）、Rituximab(美罗华）、IMC_C225(cetuximab， Erbitux，爱必妥）和 Bevacizumab (Avastin，阿瓦斯汀）等。 CHK2是近年来新发现的一个细胞周期调控蛋白。在发生DNA损伤或复制阻滞后， 细胞通过不同途径激活CHK2，进而作用于下游不同的靶蛋白，最终激活Gl、S和（或）G2/M 期检测点机制，使细胞周期进程发生阻滞，同时激活修复相关基因的转录，促进细胞对损伤 进行修复。由于CHK2在细胞周期中具有重要的负调控作用，许多学者认为CHK2起着抑癌 基因的作用，它的异常会导致细胞周期检测点对DNA损伤或复制阻滞不能发挥正常功能， 从而引起肿瘤易感性增加，最终导致肿瘤的发生或发展。 调控细胞周期是抗肿瘤药物研究的热点之一，目前研究认为细胞周期检测点途径 主要由 ATM (ataxia telangiectasia mutant)、ATR_Chkl/2 -（Mc25A、Cdc25B、(Mc25C 轴组 成，Chk2属于丝氨酸/苏氨酸激酶，是ATM(ataxia_telangiectasia mutated,共济失调毛 细血管扩张症突变基因）及ATM相关基因的下游效应基因，位于细胞周期检测点激活途径 的终端，是细胞周期检测中最关键的效应蛋白激酶。因此细胞周期检测点激酶（checkpoint kinase)CHK2,在药物、电离辐射（IR)和紫外线（UV)等引起DNA损伤后被ATM和ATR磷 酸化激活，在S期和G2期检测点调节中发挥重要作用[Rouse J，Jackson SP. Interfaces between the detection, signaling, and repair of DNA damage[J]· Science,2002, 297(5581) :547-551],是肿瘤治疗放化疗增敏的新靶点。CHK2基因位于染色体22ql2. 1。包 含14个外显子，其cDNA全长为2061bp。编码蛋白为514个氨基酸，分子量60kD ;CHK2mRNA 在正常组织中广泛存在，其蛋白在整个细胞周期中稳定表达，在没有DNA损伤时大部分处 于失活状态，在DNA损伤（尤其DNA双链断裂，DSB)后，通过CHK2分子寡聚化和自动磷酸化 而激活[Matsuoka S，Huang M，Elledge SJ. Linkage of ATM to cell cycle regulation by the Chk2protein kinase [J]· Science，1998, 282 (5395) :1893-1897]。CHK2 也不影响体细 胞正常生长.正常胚胎发育和干细胞生长也不需要CHK2.但Takai [Takai H，Naka K，Okada Y,et al. Chk2-defieient mice exhibit radioresistanee and defective p53-mediated transeription[J] .EMBO J，2002, 21 (19) :5195-5205]等发现 CHK2(-/_)鼠由于脾淋巴细 胞保存而对放射线抗拒。DNA损伤（尤其DSB)后，CHK2激酶主要由ATM激活；这也是IR引 起CHK2激活的主要路径。IR照射后ATM首先磷酸化CHK2FHA区域中第68位苏氨酸（T68)， 随后位于激酶活性区内的T383和T387自动磷酸化，使CHK2激酶激活；低剂量（0. 25Gy) 照射后DSB产生少、只引起CHK2-T68磷酸化，彡IGy照射后产生的DSB较多、才可引起 CHK2-T387 自动憐酸化而激活激酶[Buscemi G，Perego P，Carenini N，et al. Activation of ATM and Chk2 kinases in relation to the amount of DNA strand breaks [J], Oncogene，2004, 23 (46) :7691-7700]。照射后CHK2-T68磷酸化是激酶自动磷酸化激活所必 需，CHK2-T68磷酸化后才可与DNA损伤部位结合，CHK2激酶活性以及核内位点形成数目与 DNA损伤严重程度有关，并随着DNA断裂双链的重接而逐渐减弱[Ward頂，mi X，Chen J， et al.Threonine68 of Chk2 is phosphorylated at sites of DNA strand breaks[J] · J Biol Chem，2001，276 (51) :47755-47758] XHK2-S516也是照射后体内诱导磷酸化位点和体 外自动磷酸化位点，细菌、293细胞和CHK2缺乏的鼠胚胎成纤维细胞过度增殖时CHK2可被 磷酸化。体内CHK2激酶活性依赖于T383/T387和S516磷酸化。另外，UV和氧过多也经ATM 依赖和非依赖方式激活 CHK2 [Sorensen CS，Syljuasen RG，Falck J，et al. Chklregulates the S phase checkoint by coupling the physiological turnover and ionizing radiation, induced accelerated proteolysis of Cdc25A[J] · Cancer Cell,2003,3 (3)： 247-258]〇 CHK2磷酸化激活受许多蛋白调控，如Mrel 1-Rad50-Nibrin (MRN)复合物、 NBS1、E2F1、53BP1、MDC1、MRK 和 RPAl 等促进 ATM 对 CHK2-T68 磷酸化。Li [Li J，Stem DF.Regulation of Chk2by本文档来自技高网...
【技术保护点】
具有CHK2蛋白酶活性的CHK2Kinase Domain蛋白的制备方法，包括将CHK2Kinase Domain蛋白的编码核酸序列与pGEX系列载体可操作性的连接，得到重组表达载体，将该重组表达载体转化到宿主细胞中，然后诱导宿主细胞中CHK2Kinase Domain蛋白的表达，离心收集宿主细胞，超声破碎宿主细胞收集上清，经GST亲和层析和分子筛层析后即得纯化的CHK2Kinase Domain蛋白。
【技术特征摘要】
1. 具有CHK2蛋白酶活性的CHK2Kinase Domain蛋白的制备方法，包括将CHK2Kinase Domain蛋白的编码核酸序列与pGEX系列载体可操作性的连接，得到重组表达载体，将该重 组表达载体转化到宿主细胞中，然后诱导宿主细胞中CHK2Kinase Domain蛋白的表达，离心 收集宿主细胞，超声破碎宿主细胞收集上清，经GST亲和层析和分子筛层析后即得纯化的 CHK2Kinase Domain 蛋白。2. 根据权利要求1所述的制备方法，其中所述pGEX系列载体为pGEX-6p-l。3. 根据权利要求2所述的制备方法，其中，所述核酸序列通过EcoRI酶切位点和Xhol 酶切位点克隆入pGEX-6p-l。4. 根据权利要求1-3任一项所述的制备方法，其中所述核酸序列如SEQ ID NO: 1所示。5. 根据权利要求1任一项所述的制备方法，其中所述宿主细胞为BL21、BL21 (DE3)、 BL21(DE3)plyss、TransB(DE3)或 Transsetta。6. 根据权利要求5所述的制备方法，其中在所述超声破碎宿主细胞之前还包括高压碎 菌步骤，所使用的压力为1200bar。7. 根据权利要求5或6所述的制备方法，所述超声程序为功率200w，超声4秒，间隔6 秒，共40个循环。8. 根据权利要求1所述的制备方法，其中诱导宿主细胞中CHK2Kinase...
【专利技术属性】
技术研发人员：张荣光，
申请(专利权)人：常州三维生物制药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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