本发明专利技术公开了一种与人类非小细胞肺癌相关的血液miRNA标志物及其应用。该标志物为血浆外泌体来源的miRNA-375。本发明专利技术还提供了上述与人类肺癌相关的血液miRNA标志物的检测试剂及含其的试剂盒。再一方面，本发明专利技术还提供了一种检测所述的标志物miRNA-375的方法。本发明专利技术的标志物及其检测试剂可用于制备检测试剂盒，用于非小细胞肺癌的早期预判检测。与传统生物标志物不同，外泌体来源的miRNA标志物不仅稳定、微创操作、易于检测，且能够精确定量，极大提高了疾病诊断的敏感性和特异性。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物学领域，具体涉及一种miRNA 标志物及其用途。
技术介绍
肺癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一。近50年来许多国家都报道肺癌的发病率和死亡率均明显增高，男性肺癌发病率和死亡率均占所有恶性肿瘤的第一位，女性发病率占第二位，死亡率占第二位。肺癌也已跃居成为我国城市人口恶性肿瘤死亡的首位致因。非小细胞肺癌约占所有肺癌的80%，包括鳞状细胞癌（鳞癌）、腺癌等。相比小细胞癌，非小细胞肺癌细胞生长分裂较慢,扩散转移相对较晚。约75%的非小细胞肺癌患者发现时已处于中晚期，5年生存率也很低。肺癌的病因至今尚不完全明确，大量资料表明，长期大量吸烟、环境接触及慢性肺部炎症等都与肺癌的发生密切相关。目前肺癌的诊断主要依赖于影像学的检查，包括X射线、支气管镜、ECT检查、纵隔镜检查等，同时结合痰细胞学检查。但由于此类方法的限制，检测本身的敏感性和特异性都不是十分令人满意。肺癌早期症状不明显，而晚期确诊时，由于癌细胞胸膜内或/ 及胸膜外转移，病人已经丧失了手术切除病灶的机会。外泌体（Exosome）是一种直径为30-150纳米的囊泡状结构，广泛存在于血液、唾液、尿液、脑脊液等生物体液中。它形成于多种细胞，如树突状细胞、肿瘤细胞等的胞吐作用。外泌体的外膜为脂质双层结构，其内包裹有特异的蛋白、信使RNA 和非编码RNA等。外泌体中的非编码RNA以miRNA为主，且种类丰富，其可以影响干细胞分化(let-7)、器官形成(miR-1)、造血作用(miR-181)、肿瘤发生(miR-17、miR-18、miR-19a、miR-20、miR-19b-1、miR-93-1) 以及新陈代谢等诸多生理活动。miRNA 是一类短片段的非编码RNA，它们在细胞的增殖、分化及凋亡过程中均发挥了重要的作用。miRNA 通过靶向结合在信使RNA 的3’- 非编码区的特异位点上而抑制翻译或促使信使RNA的降解。miRNA 水平的异常可导致内环境的紊乱，最终导致肿瘤的发生。位于肿瘤基因相关的区域或脆性位点的miRNA 基因会在肿瘤细胞中扩增或缺失，意味着miRNA 在肿瘤恶变过程中发挥了重要作用。几乎所有的人类肿瘤细胞中都发现了miRNA的失调。外泌体中的miRNA 能以稳定的形式存在于人类的体液如血清、血浆中而不被降解，通过特定的分离纯化手段能够被检测到，这也使它有可能成为无创检测筛查的新型重要标志物。
技术实现思路
本专利技术的目的之一在于提供一种能够用于检测非小细胞肺癌的新型miRNA 标志物及其在制备非小细胞肺癌检测试剂盒中的应用。本专利技术的目的之二在于提供上述miRNA 标志物的检测试剂及其在制备非小细胞肺癌检测试剂盒中的应用。本专利技术的目的之三在于提供一种检测上述miRNA 标志物的方法。为了实现上述目的：一方面，本专利技术提供了一种与人类非小细胞肺癌相关的血液miRNA 标志物，所述标志物是血液中外泌体来源的miRNA-375，其序列信息如SEQ ID NO:1 所示。本专利技术还提供了与人类肺癌相关的血液miRNA 标志物在制备检测人类非小细胞肺癌试剂盒中的应用，所述标志物是血液中外泌体来源的miRNA-375，其序列信息如SEQ ID NO:1所示。另一方面，本专利技术还提供了上述与人类肺癌相关的血液miRNA 标志物的检测试剂。所述试剂包括反转录引物和/ 或扩增引物；所述反转录引物为miRNA特异的颈环结构引物，序列如SEQ ID NO:2所示；所述扩增引物的上游引物序列如SEQ ID NO:3 所示，所述扩增引物的下游引物为通用反向引物，序列如SEQ ID NO:4所示。所述引物通常在QPCR 实验中使用。再一方面，本专利技术还提供了与人类非小细胞肺癌相关的血液miRNA 标志物的检测试剂 在制备检测人类非小细胞肺癌的试剂盒中的应用，所述试剂包括QPCR 实验中使用的反转录引物和/ 或扩增引物；所述反转录引物为miRNA特异性的颈环结构引物，序列如SEQ ID NO:2所示；所述扩增引物的上游引物序列如SEQ ID NO:3 所示，所述扩增引物的下游引物为通用反向引物，序列如SEQ ID NO:4所示。所述检测试剂盒包含上述引物序列。再一方面，本专利技术还提供了一种检测人类非小细胞肺癌的试剂盒，所述试剂盒包含与人类非小细胞肺癌相关的血液miRNA 标志物的检测试剂，所述试剂包括反转录引物和/ 或扩增引物；所述反转录引物为miRNA特异性的颈环结构引物，序列如SEQ ID NO:2所示；所述扩增引物的上游引物序列如SEQ ID NO:3 所示，所述扩增引物的下游引物为通用反向引物，序列如SEQ ID NO:4所示。所述引物通常在QPCR 实验中使用。优选地，本专利技术的检测试剂盒还包含QPCR 常用的试剂和酶，还可以包括标准品和/ 或对照品。所述常用试剂包含PCR 反应缓冲液、核糖核酸酶抑制剂、dNTP 等；所述酶包含M-MLV 逆转录酶、基因组DNA消化酶（gDNA Eraser）等。再一方面，本专利技术还提供了一种检测所述的标志物miRNA-375的方法，包括：(1) 分离纯化血液中的外泌体；(2) 提取样本总RNA ；(3) 将步骤(2) 获得的RNA 逆转录成cDNA ；(4) 在荧光实时定量PCR 仪上将miRNA 和参照基因进行扩增检测；(5) 通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，ΔΔCT 法进行相对定量。优选地，步骤(3)中所述RNA 逆转录成cDNA 时使用的引物，序列如SEQ ID NO:2所示；步骤(4)中进行所述扩增时使用的扩增引物中，上游引物的序列如SEQ ID NO:3 所示，下游引物的序列如SEQ ID NO:4所示。优选地，步骤(4)中参照基因为snRNA U6。作为示例，步骤(1) 具体的操作为：a.新鲜采集的外周血或者融化的冻存状态血浆在室温下2000*g 离心20min，除去细胞和细胞碎片；b.取上清移至新的离心管，室温下10000*g离心20min，进一步除去细胞碎片；c.取上层液体移入离心管，加入0.5倍体积的1X PBS溶液，涡旋混匀；d.加入适量总外泌体分离试剂（Invitrogen），混匀；优选500μl 起始血浆中加入350μl 分离试剂；e.混合液载室温下10000*g 离心5min (此时，外泌体富集于管底部) ；f.吸出移去所有上清；g.用25μl 1X PBS溶液重悬全部沉淀，-20℃保存。作为示例，步骤(2) 的具体实施方法为：a.加入700μl TRIzol溶液，用力震荡至呈现均一液相，室温静置5min ；b.加入氯仿350μl，用力振荡离心管，充分混匀，室温静置5min；c.4℃条件下，12000rpm高速离心15min 后吸取上层水相到新的离心管中, 注意不要吸到两层水相之间的蛋白质层；d.加入等体积的异丙醇，充分颠倒混匀，在-20℃条件下静置20min；e.4℃条件下，12000rpm高速离心15min 后小心弃掉上清液，加入1ml 预冷的75％乙醇洗涤沉淀，4℃下7500rpm高速离心5min；f.弃去液体，室温下放置5min 以充分晾干沉淀，加入不含RNase的无菌水溶解沉淀；g.用Nanodrop2000 紫外分光光度计测量RNA 纯度及浓度，样品冻存于-80℃。作本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种与人类非小细胞肺癌相关的血液miRNA标志物，其特征在于，所述miRNA标志物是外泌体来源的miRNA‑375，其序列如SEQ ID NO:1 所示。
【技术特征摘要】
1.一种与人类非小细胞肺癌相关的血液miRNA标志物，其特征在于，所述miRNA标志物是外泌体来源的miRNA-375，其序列如SEQ ID NO:1 所示。2.权利要求1 所述的miRNA 标志物的检测试剂，其特征在于，所述试剂包括反转录引物和扩增引物；所述反转录引物，序列如SEQ ID NO:2所示；所述扩增引物的上游引物的序列如SEQ ID NO:3 所示，所述扩增引物的下游引物的序列如SEQ ID NO:4所示。3.权利要求2 所述的miRNA标志物的检测试剂在制备人类非小细胞肺癌检测试剂盒中的应用。4.一种人类非小细胞肺癌检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包含权利要求2 所述的试剂。5.根据权利要求4 所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒还包含定量PCR 反应常用的试剂和酶。6.一种...
【专利技术属性】
技术研发人员：王家亮，王昉炜，李辉辉，刘月星，
申请(专利权)人：上海润腾生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31
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