AnnexinV‑FITC细胞凋亡试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了AnnexinV‑FITC细胞凋亡试剂盒，所述试剂盒包括：含0.6‑0.8％BSA的PBS缓冲液，含2.5‑4％多聚甲醛的PBS缓冲液，含0.6‑0.8％Triton X‑100和0.06‑0.08％吐温40的PBS缓冲液，兔抗caspase‑3一抗，带有Alexa Fluor488绿色荧光素标记的山羊抗兔IgG二抗，含18‑22μM DAPI的PBS缓冲液。所述兔抗caspase‑3一抗是用合成的人caspase‑3蛋白中靠近Asp175的氨基末端残基的多肽抗原免疫兔子获得的多克隆抗体；兔抗caspase‑3一抗按1:600的体积比稀释于封闭液中。所述山羊抗兔IgG二抗按1:600的体积比稀释于封闭液中；其中，所述封闭液为含10％山羊血清和0.06‑0.08％吐温40的PBS液。本发明专利技术能对凋亡细胞进行准确定性和定量检测，灵敏度高、特异性强，操作简单，重复性好，效率高。

AnnexinV FITC apoptosis Kit

The invention discloses AnnexinV FITC apoptosis kit, the kit includes: PBS buffer containing 0.6 0.8%BSA, PBS buffer containing 2.5 4% paraformaldehyde, containing 0.6 0.8%Triton X PBS buffer 100 and 0.06 0.08% Twain 40, Rabbit anti caspase 3 anti Alexa Fluor488, with green fluorescein labeled Goat anti Rabbit anti IgG two, PBS 18 buffer containing 22 M DAPI. The Rabbit anti caspase antibody was 3 polyclonal antibody antigen immune rabbit N-terminal residues near the Asp175 synthesis of human caspase protein in 3 obtained; Rabbit anti caspase 3 - at the volume ratio of 1:600 diluted in blocking buffer. The Goat anti Rabbit anti IgG two according to the volume ratio of 1:600 diluted in blocking solution; wherein the sealing fluid is PBS containing 10% goat serum and 0.06 0.08% Twain 40. The invention can accurately and quantitatively detect apoptotic cells, has the advantages of high sensitivity, strong specificity, simple operation, good repeatability and high efficiency.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及细胞生物学领域及免疫荧光技术，具体是AnnexinV-FITC细胞凋亡试剂盒。
技术介绍
细胞凋亡 (apoptosis) 是细胞为维持内环境稳定，更好地适应生存环境而主动形成的一种自我死亡过程，它涉及一系列基因的激活、表达及调控等作用。大量的光镜及超微结构的研究分析证明哺乳动物附植前的胚胎就可以观察到细胞凋亡的发生，胚胎细胞的凋亡有利于胚胎去除发育异常的细胞，但研究结果发现细胞凋亡与胚胎发育的停滞相关，超出某一程度的凋亡不利于胚胎的发育。因此研究着床前胚胎细胞的凋亡将有助于正确理解胚胎的发育过程，改进体外培养体系，提高胚胎质量，解决哺乳动物胚胎流产率高的问题。Annexin V是一种检测细胞凋亡的试剂，在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸只分布在细胞膜脂质双层的内侧，细胞发生凋亡早期，膜磷脂酰丝氨酸（PS）由脂膜内侧翻向外侧。Annexin V作为一种磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，它通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。因此Annexin V是检测细胞早期凋亡的灵敏指标。而且Caspase-3 常被用作细胞凋亡检测的标志物。目前对胚胎质量的评价指标主要是囊胚细胞总数和 ICM/TE，计数方法是染色后不同类型的细胞分别统计，然而其所用的染色方法受不同的动物品种、囊胚大小与细胞总数，通透剂的浓度和染料作用时间等多种因素的影响，导致对不同发育期的囊胚需要进行反复多次的条件摸索，因此该方法的可重复性差。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供灵敏度高、特异性强、操作简单、重复性好、效率高的AnnexinV-FITC细胞凋亡试剂盒，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：AnnexinV-FITC细胞凋亡试剂盒，所述试剂盒包括：含0.6-0.8％BSA的PBS缓冲液，含2.5-4％多聚甲醛的PBS缓冲液，含0.6-0.8％Triton X-100和0.06-0.08％吐温40的PBS缓冲液，兔抗caspase-3一抗，带有Alexa Fluor488绿色荧光素标记的山羊抗兔IgG二抗，含18-22μM DAPI的PBS缓冲液。作为本专利技术进一步的方案：含0.7％BSA的PBS缓冲液。作为本专利技术进一步的方案：含3％多聚甲醛的PBS缓冲液。作为本专利技术进一步的方案：含0.7％Triton X-100和0.07％吐温40的PBS缓冲液。作为本专利技术进一步的方案：含20μM DAPI的PBS缓冲液。作为本专利技术进一步的方案：所述兔抗caspase-3一抗是用合成的人caspase-3蛋白中靠近Asp175的氨基末端残基的多肽抗原免疫兔子获得的多克隆抗体；兔抗caspase-3一抗按1:600的体积比稀释于封闭液中；其中，所述封闭液为含10％山羊血清和0.06-0.08％吐温40的PBS液。作为本专利技术进一步的方案：所述山羊抗兔IgG二抗按1:600的体积比稀释于封闭液中；其中，所述封闭液为含10％山羊血清和0.06-0.08％吐温40的PBS液。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：本专利技术采用针对caspase-3一抗和携带荧光素的二抗进行抗原抗体反应，对胚胎中的凋亡细胞进行荧光标记和计数；再用DNA染料着色所有细胞的细胞核，从而计算出囊胚细胞的凋亡率。本专利技术结合荧光显微镜，能对凋亡细胞进行准确定性和定量检测，灵敏度高、特异性强，操作简单，重复性好，效率高。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。实施例1本专利技术实施例中，AnnexinV-FITC细胞凋亡试剂盒，所述试剂盒包括：含0.6％BSA的PBS缓冲液，含2.5％多聚甲醛的PBS缓冲液，含0.6％Triton X-100和0.06％吐温40的PBS缓冲液，兔抗caspase-3一抗，带有Alexa Fluor488绿色荧光素标记的山羊抗兔IgG二抗，含18μM DAPI的PBS缓冲液。所述兔抗caspase-3一抗是用合成的人caspase-3蛋白中靠近Asp175的氨基末端残基的多肽抗原免疫兔子获得的多克隆抗体；兔抗caspase-3一抗按1:600的体积比稀释于封闭液中；其中，所述封闭液为含10％山羊血清和0.06％吐温40的PBS液。所述山羊抗兔IgG二抗按1:600的体积比稀释于封闭液中；其中，所述封闭液为含10％山羊血清和0.06％吐温40的PBS液。实施例2本专利技术实施例中，AnnexinV-FITC细胞凋亡试剂盒，所述试剂盒包括：含0.8％BSA的PBS缓冲液，含4％多聚甲醛的PBS缓冲液，含0.8％Triton X-100和0.08％吐温40的PBS缓冲液，兔抗caspase-3一抗，带有Alexa Fluor488绿色荧光素标记的山羊抗兔IgG二抗，含22μM DAPI的PBS缓冲液。所述兔抗caspase-3一抗是用合成的人caspase-3蛋白中靠近Asp175的氨基末端残基的多肽抗原免疫兔子获得的多克隆抗体；兔抗caspase-3一抗按1:600的体积比稀释于封闭液中；其中，所述封闭液为含10％山羊血清和0.08％吐温40的PBS液。所述山羊抗兔IgG二抗按1:600的体积比稀释于封闭液中；其中，所述封闭液为含10％山羊血清和0.08％吐温40的PBS液。实施例3本专利技术实施例中，AnnexinV-FITC细胞凋亡试剂盒，所述试剂盒包括：含0.7％BSA的PBS缓冲液作为洗液，含3％多聚甲醛的PBS缓冲液作为固定液，含0.7％Triton X-100和0.07％吐温40的PBS缓冲液作为通透液，兔抗caspase-3一抗作为一抗，带有Alexa Fluor488绿色荧光素标记的山羊抗兔IgG二抗作为二抗，含20μM DAPI的PBS缓冲液作为染色液。所述兔抗caspase-3一抗是用合成的人caspase-3蛋白中靠近Asp175的氨基末端残基的多肽抗原免疫兔子获得的多克隆抗体；兔抗caspase-3一抗按1:600的体积比稀释于封闭液中；其中，所述封闭液为含10％山羊血清和0.07％吐温40的PBS液。所述山羊抗兔IgG二抗按1:600的体积比稀释于封闭液中；其中，所述封闭液为含10％山羊血清和0.07％吐温40的PBS液。将实施例3的试剂盒用于牛囊胚细胞凋亡检测，差异染色程序如下 (以下所有染色操作均在四孔板中完成)：a.将牛囊胚在37℃洗液中洗3次；b.使用固定液室温固定20min，四孔板每孔最多25枚囊胚；c.在通透液中室温处理30min，每孔500μL通透液，每孔最多25枚囊胚；d.取出囊胚，在洗液中清洗3次；e.在2MHCl中室温处理20min；f.在100mMTris-HCl中室温处理20min；g.取出囊胚，在洗液中清洗3次；h.放入封闭液中，4℃过夜；i.取出囊胚移入兔抗caspase-3一抗中，室温孵育2h；j.取出囊胚，在洗液中洗3次，每次5min以上；k.将囊胚放入标记Alexa Fluor488的山羊抗兔IgG中，室温孵育2h，避光；l.本文档来自技高网...

【技术保护点】
AnnexinV‑FITC细胞凋亡试剂盒，其特征在于，包括：含0.6‑0.8％BSA的PBS缓冲液，含2.5‑4％多聚甲醛的PBS缓冲液，含0.6‑0.8％Triton X‑100和0.06‑0.08％吐温40的PBS缓冲液，兔抗caspase‑3一抗，带有Alexa Fluor488绿色荧光素标记的山羊抗兔IgG二抗，含18‑22μM DAPI的PBS缓冲液。

【技术特征摘要】
1.AnnexinV-FITC细胞凋亡试剂盒，其特征在于，包括：含0.6-0.8％BSA的PBS缓冲液，含2.5-4％多聚甲醛的PBS缓冲液，含0.6-0.8％Triton X-100和0.06-0.08％吐温40的PBS缓冲液，兔抗caspase-3一抗，带有Alexa Fluor488绿色荧光素标记的山羊抗兔IgG二抗，含18-22μM DAPI的PBS缓冲液。2.根据权利要求1所述的AnnexinV-FITC细胞凋亡试剂盒，其特征在于，含0.7％BSA的PBS缓冲液。3.根据权利要求1所述的AnnexinV-FITC细胞凋亡试剂盒，其特征在于，含3％多聚甲醛的PBS缓冲液。4.根据权利要求1所述的AnnexinV-FITC细胞凋亡试剂盒，其特征在于，含0.7％Triton X-100和0....

【专利技术属性】
技术研发人员：马永江，
申请(专利权)人：广州杰特伟生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44