用于使用发光检测生物分子的方法和试剂技术

本发明专利技术涉及包含至少两个不同尺寸的金属原子量子簇(AQC)之电荷转移复合物和生物素结合分子(优选链霉亲和素)的发光复合物及其用于检测生物素化化合物的用途。本发明专利技术还涉及包含AQC的电荷转移复合物和生物分子的缀合物的用途及其用于基于AQC纳米系统的发光性能检测样品中生物分子的结合伴侣的用途。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及用于使用与金属原子量子簇（atomic quantum cluster，AQC)之电荷 转移复合物（charge-transfer complex)偶联的目的生物分子的结合伴侣检测生物分子的 方法和试剂。本专利技术还涉及使用金属原子量子簇之电荷转移复合物和生物素化分子的竞争 性结合测定。
技术介绍
荧光染料与生物分子如多核苷酸、蛋白质、脂质等的缀合可用于检测、分离和/或 鉴定生物分子。这种缀合物通常来源于染料与能够结合给定靶标或结合伴侣之试剂的结 合。对于旨在用作检测蛋白质或核酸之标记（marker)的染料来说，有多种性质可能是期望 的。这些可包括在不影响其周围基质的情况下被激发的能力、容易检测、高量子产量、对于 培养基的适应性、稳定性、长平均寿命、无毒性、荧光参数随时间的再现性以及允许染料与 核苷酸或其他期望靶标连接的反应性基团的存在。 今天，仅有的已知具有大于200nm的巨大斯托克斯位移和超过1微秒的慢衰减时 间的一些荧光系统是基于稀土离子的。但是，它们表现出多种缺点，例如：难以在不损失 其荧光特性的情况下将其引入到基质中；存在对应于每一种稀土的固定且特定的激发、发 射和斯托克斯位移特性，因此不易改变，并且它们是昂贵且稀有的材料。这些系统的实例 描述在以下文献中：Sardar，D.K.等，Biophotonics，January 2008 ;Resch_Genger，U.， Advanced Fluorescence Reporters in Chemisrty and Biology II Springer Series on Fluorescence，2010,第 9 卷，第 I 部分，3-40 ;Harma H.等，Analytical Chemistry，2005， 77,2643-2648 ;US7465747B2 ;US2010/0224831A1 和 US4283382。 因此，有必要使荧光染料与生物分子缀合，这可用作发光探针并且克服了基于稀 土元素的含染料之缀合物的这些缺点。
技术实现思路
本专利技术的作者惊奇地发现，AQC的电荷转移复合物与链霉亲和素相互作用导致其 荧光发射强度增加，并且该作用可在生物素或生物素结合分子的存在下逆转。不希望受到 任何理论的约束，认为AQC的电荷转移复合物与链霉亲和素的相互作用导致AQC的构象改 变，这导致强度增加，并且认为AQC的电荷转移复合物与链霉亲和素通过生物素结合口袋 (biotin-binding pocket)相互作用，由于生物素对链霉亲和素更高的亲和力导致该相互 作用在生物素或生物素结合分子的存在下被逆转。 由于AQC包含金属过渡元素，这些可选自在以非常低的浓度存在时无毒的那些， 例如Au或Ag。此外，这些元素极大的天然丰度使得这成为一种完全可持续的方法。此外， AQC和包含所述AQC的复合物表现出以下优点： -在自然光和室温下储存至少1年的时期稳定而不失去其性质， -在3至10的pH范围下稳定， -可被浓缩直至干而不失去其荧光性能，即使以干燥的形式， --旦干燥，可再溶解而不失去其荧光性能，并且还-在比基于稀土元素的发光系统所使用浓度低的浓度下使用。 该观察允许在链霉亲和素或生物素结合分子的存在下使用AQC的电荷转移复合 物检测生物素或生物素化分子。 因此，在第一个方面，本专利技术涉及复合物，其包含生物素结合分子和通式（I)的至 少两个不同尺寸的金属原子量子簇（AQC)MjP Μ' n，的电荷转移复合物： Mn+M'n, (I)， 其中 金属AQC的金属M和Μ'是相同金属或不同金属， Mn是以其氧化形式M η+存在的较小AQC， Μ'η，是以其还原形式Μ' η，存在的较大AQC， Μη+和Μ' η，通过静电相互作用结合， η和n'分别为M和Μ'的金属原子数目，并且 η 小于 η，， 其中所述生物素结合分子与所述电荷转移复合物不共价结合。 在另一个方面，本专利技术涉及成套试剂盒（kit-of-parts)，其包含一起的或分开 的： ⑴至少两个不同尺寸的金属原子量子簇（AQC)MjPM' n，的电荷转移复合物，其中 所述电荷转移复合物具有权利要求1限定的式I，并且其中所述金属AQC的M和M'是相同 金属或不同金属，Mn是以其氧化形SM n+存在的较小AQC，Μ' n，是以其还原形式Μ' n，存在 的较大AQC，Mn+和Μ' n，通过静电相互作用结合，η和n'分别为金属原子的数目，以及 (ii)生物素结合分子。 在另一个方面，本专利技术涉及用于检测样品中的生物素化分子的方法，其包括以下 步骤： (i)使所述样品与根据本专利技术的复合物在足以使生物素化分子与复合物中的生物 素结合分子结合的条件下接触，以及 (ii)检测在步骤（i)的所述接触之后在CTC的激发波长下响应于所述样品之激发 的所述CTC的荧光发射强度的变化， 其中接触步骤后CTC发射的荧光强度的降低指示样品中存在生物素化分子。 在另一个方面，本专利技术涉及缀合物，其包含生物分子和通式（I)的至少两个不同 尺寸的金属AQC MjP Μ' n，的电荷转移复合物： Mn+M'n, (I)， 其中 金属AQC的金属M和Μ'是相同金属或不同金属， Mn是以其氧化形式M η+存在的较小AQC， Μ'η，是以其还原形式Μ' η，存在的较大AQC， Μη+和Μ' η，通过静电相互作用结合， η和n'分别为M和Μ'的金属原子数目，并且 η 小于 η，， 其中所述缀合物还包含与所述原子量子簇M和Μ'连接的ω-羟基酸配体和ω-巯 基酸配体，其中所述生物分子与所述ω-羟基酸配体和/或所述ω-巯基酸配体连接。 在一些方面中，本专利技术涉及根据本专利技术的缀合物，其用于检测样品中的生物分子 或用于检测细胞内组分。 附图简述 图1示出了在存在链霉亲和素并且（A)不存在生物素化分子、（B)存在0.1 mmol生 物素化寡核苷酸和（C)存在0. 5mmol生物素化寡核苷酸的情况下的AQC-CTC的发射光谱。 图2示出了在存在链霉亲和素和HABA并且（A)不存在生物素化寡核苷酸和（B) 存在生物素化寡核苷酸的情况下的AQC-CTC的发射光谱。 术语定义 本文中使用的术语"抗体"指免疫球蛋白分子以及免疫球蛋白分子的免疫活性部 分，即，包含与抗原特异性结合（"与其免疫反应"）的抗原结合位点的分子。非限制性实 例包括抗体、抗体片段、重组抗体、非人抗体、嵌合抗体、人源化抗体或全人抗体。在结构 上，最简单的天然存在抗体（例如，IgG)包含4条多肽链，即通过二硫键相互连接的两条重 (H)链和两条轻（L)链。免疫球蛋白代表一个大的分子家族，其包括若干类分子，例如IgD、 IgG、IgA、IgM和IgE。术语"免疫球蛋白分子"包括例如杂合抗体或经修饰抗体（altered antibody)及其片段。已表明，抗体的抗原结合功能可由天然存在抗体的片段来执行。这些 片段统称为"抗原结合单位"。抗原结合单位基于其分子结构可广泛分为"单链"（"Sc"）和 "非单链"（"Nsc"）类型。术语"抗体"还涵盖多种物种起源的免疫球蛋白分子，所述物种 包括无脊椎动物和脊椎动物。术语"人"在应用于抗体或抗原结合单位时指由人基因表达的 免疫球蛋白分子或本文档来自技高网...

【技术保护点】
复合物，其包含生物素结合分子和通式(I)的至少两个不同尺寸的金属原子量子簇(AQC)Mn和M’n’的电荷转移复合物(CTC)：Mn+M’n′‑   (I)，其中所述金属AQC的金属M和M’是相同金属或不同金属，Mn是以其氧化形式Mn+存在的较小AQC，M’n’是以其还原形式M’n’‑存在的较大AQC，Mn+和M’n’‑通过静电相互作用结合，n和n′分别为M和M’的金属原子数目，并且n小于n′，其中所述生物素结合分子与所述电荷转移复合物不共价结合。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：曼纽尔·阿图罗·洛佩斯金特拉，费尔南多·多明格斯普恩特，乔斯·M·希梅诺多纳克，
申请(专利权)人：纳米隙亚纳米粉末有限公司，潘加埃亚生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：西班牙;ES