微菌落分子信标培养结核菌诊断试剂盒及制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了微菌落－分子信标检测法，一种用于结核杆菌快速培养的诊断试剂盒。同时阐明了该诊断试剂盒的制备方法；并就其临床应用做了科学的表述。尤为重要的是指明了该诊断试剂盒的临床应用价值和巨大的开发前景。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术所属领域包括以下内容(一) 分子生物学范畴。(二) 细菌生物特征研究领域。(三) 传染性疾病诊断医学研究领域。二
技术介绍
(一) 分子生物学本申请的主体是结核杆菌的分子信标探针。选择结核杆菌特有的序列ropB, IS6110为耙序列设计引物和探针检测结核杆菌。(二) 细菌生物特征研究通过结核杆菌的微菌落培养以后，证明接种的细菌是活菌。(三) 传染性疾病诊断医学研究。结核病俗称"肺痨"，是由结核杆菌侵入人体后引起的一种具有强烈传染性的慢性消耗性 疾病。近年来由于结核杆菌耐药性增强、人口流动增加、艾滋病发病率升高、以及有些国家 和地区忽视对结核病的控制，结核病有重薪抬头的趋势，再次成为危害人类健康的疾病之一。据世界卫生组织估计，目前全世界约有20亿人受结核分枝杆菌感染，5000万人感染耐药 结核杆菌，每年有800万人新感染结核杆菌，300万人死于结核病。我国是世界上22个结核病 高负担国家之一，患者人数仅次于印度居全球第二位。世界卫生组织2004年召开的第二届全 球遏制结核病伙伴论坛大会上，将我国列在需要特别引起警示的国家和地区的首位。具体表 现为6 "多"感染人数多、患病人数多、新发患者多、死亡人数多、农村患者多、耐 药患者多。目前常用的方法1.抗酸染色2.培养法3.分子生物学法。 为了克服抗酸染色特异性和敏感性低、传统培养耗时长，PCR方法存在假阳性、假阴性、产 物分析容易污染环境等缺点，探索建立一种微菌落培养法和分子信标检测法联合应用检测结 核杆菌的方法。三
技术实现思路
(一)专利技术的特征1、由于结核杆菌生长非常缓慢，大约需要12小时才能分裂一代，需要4-8周才能长出可见 菌落，不利于结核病的诊断和流行病学调査。为了达到快速检验的目的，本专利技术提供了一种用于快速检测生物样品中是否存在结核杆菌以及鉴定结核杆菌死活的方法。其特征是将结 核杆菌涂布于贴在结核杆菌选择性培养基上的醋酸纤维素膜上孵育，12-72小时，可借助于普 通光学显微镜观察到结核杆菌的微菌落形态。2、 微菌落法看到形成微菌落以后，证明接种的细菌是活菌，但不能判断是否是结核分枝杆菌为此本专利技术提供了一种具有高特异性、高灵敏度的用于结核杆菌检测的分子信标探针。其特征是选择结核杆菌特有的序列r叩B,IS6110为靶序列设计引物(具有序列表〈210〉 3，序列 表〈210〉 4，序列表〈210〉6，序列表<210> 7的多核苷酸序列)和双重探针(具有序列表〈210〉5， 序列表〈210> 8的多核苷酸序列)检测结核杆菌。3、 由2、所描述的多核苷酸序列经PCR扩增出215/233bp (rpoB)和114bp (IS6110)两个结 核杆菌的片段，分别是具有序列表〈210〉1，序列表〈210〉 2的多核苷酸序列。其特征是与 结核杆菌的原基因序列完全相同。4、 ropB、 IS6110双分子信标方法的特异性为95-100%，灵敏度1-100个菌/ml。5、 所建立的微菌落(microcolony， MC)-分子信标检测法的线性范围是103-1011copies/ml， 扩增效率达90%以上。(二)微菌落-分子信标检测的应用特点1、 高特异性结核分枝杆菌微菌落培养+ DNA分子信标。2、 高灵敏度临床标本中结核分枝杆菌浓度《10—20个/ml即可检出。3、 快速 标本处理后，仅12-72小时内可报告结果。4、 准确 10-12 h可看到结核杆菌菌落，不仅只检出结核分枝杆菌的活菌，而且由于在同一个PCR反应中采用多种不同的分子信标探针来检测结核分枝杆菌对利福平的耐药 情况，每种探针用不同的荧光素标记，不同种探针与靶序列完全结合后覆盖了 MTB RNA聚合酶rpoB基因的整个核区域，因此，可同步检测结核分枝杆菌的耐药株。5、 简单,常规操作，极易掌握。6、 方便且适用范围广泛1)可检测痰液、胸水、腹水、脑脊液、尿、骨髓等多种标本。 2)用于结核病的实验诊断。3)抗痨玲疗效果的评价。4)尤其是初诊病人的鉴别诊断。 5)用于结核菌耐药性的快速检测。6)用于HIV高危人群的鉴别诊断。7)可检出大 量涂片漏诊患者，可用于HIV高危人群的鉴别诊断。8)对环境无污染。四、专利技术目的针对现有检测结核分枝杆菌技术的不足，本专利技术的目的在于建立一种微菌落快速培养结 核杆菌以及提供一种用于检测结核分枝杆菌的特有的引物和分子信标及其试剂盒的制备方 法，以便供临床检测和科学研究之用。本专利技术为快速培养检测结核杆菌而设计的微菌落培养方法、靶序列RT-PCR引物、DNA 分子信标探针、试剂盒和检测方法及其应用。51、 本专利技术还提供了一种用于快速检测生物样品中是否存在结核杆菌以及鉴定结核杆菌死活的 方法。其步骤包括，(1) 将生物标本接种到贴在罗琴氏培养基上的醋酸纤维素膜上，培养前后均做微菌落实 验，看是否有微菌落形成，以确定细菌的死活。(2) 采集接种有结核杆菌且培养12-72小时的醋酸纤维素膜，用无菌剪刀剪碎后放入EP 管中，加入200ulDNA提取液(3) 然后置于沸水中水浴10分钟，制备DNA模板，(4) 将步骤b)得到的DNA模板进行real time PCR扩增处理(5) 反应结束后利用软件进行数据分析由于结核杆菌生长非常缓慢，大约需要12小时才能分裂一代，需要4-8周才能长出可见 菌落，不利于结核病的诊断和流行病学调查。为了达到快速检验的目的，利用显微镜尽可能 早的观察结核杆菌的生长情况不失为一种可行的方法。用微菌落培养法看到形成微菌落以后，证明接种的细菌是活菌，但不能判断是否是结核 分枝杆菌。为此选择结核杆菌特有的序列ropB,IS6110为靶序列设计引物和探针检测结核杆 菌。2、 为了实现上述目的针对结核杆菌的特点，首先选择相应的靶序列，然后针对相应的靶序 列设计特异性的'引物，扩增出特异性的目的DNA片段。因此待测基因两端的DNA序列的引 物设计也是本专利技术的要点。本专利技术提供了两对检测结核杆菌的引物序列，如下Tbl f: CAAggAgTTCTTCggCACCTbl r: AgCCgATCAgACCgATgTT TB2 f:gCCTACgTggCCTTTgTC TB2 r:ggTCCAgATggCTTgCTC3、 本专利技术还提供了检测上述两个靶序列的而设计的两个探针，其序列为Tbl probe: fam+CAgCgCgTgAgCgTgCCgggCTgCgCTg+dabcylTb2 probe: hex+CAgCgACgCCTACgCTCgCAggATCCTCgCTg+dabcyl其中环状部分与所述靶序列是完全互补的序列。本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体/转录调控元件(如启动子、增强子等) 和选择性标记基因。4、 提供分别含有结核杆菌ropB和IS6110的多核苷酸基因工程化的宿主细胞。本专利技术中， 结核杆菌ropB和IS6110多核苷酸或含有该多核苷酸的重组载体可转化或转导入宿主细胞， 以构成含有该多核苷酸或重组载体的基因工程化宿主细胞。术语"宿主细胞"指原核细胞， 如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表 性例子有大肠杆菌，链霉菌属；细菌细胞如鼠伤寒沙门氏菌；真菌细胞如酵母；植物细胞; 昆虫本文档来自技高网...

【技术保护点】
为微菌落分子信标培养结核菌诊断试剂盒及制备方法和应用而设计的、为ＰＣＲ扩增结核杆菌选定的靶序列而设计的两对引物，所述引物为以下的两对引物：　Ｔｂ１　ｆ：ＣＡＡｇｇＡｇＴＴＣＴＴＣｇｇＣＡＣＣ　Ｔｂ１　ｒ：ＡｇＣＣｇＡＴＣＡｇＡＣＣｇＡ ＴｇＴＴ　ＴＢ２　ｆ：ｇＣＣＴＡＣｇＴｇｇＣＣＴＴＴｇＴＣ　ＴＢ２　ｒ：ｇｇＴＣＣＡｇＡＴｇｇＣＴＴｇＣＴＣ

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：朱玲，
申请(专利权)人：福建医科大学，
类型：发明
国别省市：35[中国|福建]