【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种基于磷脂酶酶促标记的细胞膜蛋白富集方法。
技术介绍
1、膜蛋白是指一类与细胞质膜或细胞器膜相结合的蛋白质，可以通过跨过或部分嵌入磷脂双分子层等多种方式与膜结合，是生物膜基本结构的重要组成之一，也是细胞多种重要生理功能的执行者，在信号转导、代谢物转运、能量转换和细胞粘附等许多细胞过程中起关键作用，超过50%的药物分子靶向膜蛋白，包括g蛋白偶联受体（gpcr）和离子通道。然而，由于质膜蛋白质丰度低，且缺乏可被特异性捕获的基团，发展新型质膜蛋白富集方法对于疾病机理的探究及治疗靶标的发现具有重要意义。
2、最早期发展的细胞质膜富集方法是密度梯度离心法（proceedings of thenational academy of sciences, 1972, 69(11): 3307-3311），此类方法虽普适性强、操作简单，但质膜与某些细胞器（尤其是线粒体、高尔基体和内质网）密度接近或有部分重叠，易对质膜的富集产生干扰，纯度较低。双相萃取法则利用质膜蛋白的表面电荷和极性与其他蛋白质不同使得质膜蛋白与其他蛋白对两个不相溶的水性聚合物相的亲和力不同从而实现膜蛋白分离纯化（tumor biology, 2011, 32: 1013-1021；journal of proteomeresearch, 2008, 7(01): 432-442）。应用较为广泛的水性聚合物有聚乙二醇（peg）和葡聚糖，双相萃取法聚合物原料便宜、分离效果明显且两相系统对膜结构和膜功能比较温和，可保留蛋白质之间的相互作用。但在水相聚合物两相
技术实现思路
1、为克服现有技术中细胞表面功能基团不足，致使细胞膜表面引入富集靶标的效率有限，导致膜蛋白富集效率较低的问题，本专利技术提供一种可在细胞表面修饰高密度富集靶标的细胞膜蛋白富集方法--一种基于磷脂酶酶促标记的细胞膜蛋白富集方法，本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：
2、所述的基于磷脂酶酶促标记的细胞膜蛋白富集方法，包括：在细胞膜表面修饰生物素，裂解细胞，基于生物素亲和素的亲和相互作用介导细胞膜表面结合亲和素-磁性纳米粒子，质膜蛋白纯化，质膜蛋白酶解和lc-ms/ms鉴定，其特征在于：所述细胞膜表面修饰生物素，通过磷脂酶酶促标记细胞膜磷脂双分子层，于细胞膜表面引入炔基；进一步利用炔-叠氮点击化学反应标记生物素，使细胞膜修饰上生物素。
3、所述的磷脂酶酶促标记细胞膜磷脂双分子层，标记方法如下：细胞刮下置于新鲜的完全培养液中，加入终浓度为36 mm 炔醇、2 mg/ml pld酶及4 mm cacl2，溶液吹打混匀，于条件为37 ℃、5% co2的培养箱中反应1小时；
4、所述的炔-叠氮点击化学反应标记生物素，标记方法如下：细胞置于1×pbs中，加入终浓度为0.01 mm含生物素和叠氮的双功能试剂，再加入可催化炔-叠氮点击化学反应的催化剂，于条件为37℃、5% co2的培养箱中反应10 min；
5、所述的裂解细胞，裂解方法如下：将细胞置于由3% bsa，1×pbs和1%（v/v）cocktail组成的细胞裂解液中，通过5 ml注射器将细胞悬液吸入注射器室，去除针头，排出注射器室内的空气，使细胞悬液远离尖端约3 mm，用5-6层封口膜覆盖注射器尖端，将被盖住的注射器尖端牢固地压在壁上，最大限度地向后拉柱塞并释放，重复5-6次，离心取上清；
6、所述基于生物素亲和素的亲和作用介导细胞膜表面结合亲和素-磁性纳米粒子，结合方法如下：所得细胞裂解液中加入亲和素-磁球，混匀，冰上振摇30 min，再加入0.2 mm含生物素和叠氮的双功能试剂封闭未反应的亲和素，冰上振摇20 min；
7、所述质膜蛋白纯化，纯化方法如下：用盐溶液清洗结合细胞膜的亲和素-磁球，以洗脱非特异性吸附，再向磁球中加入含有表面活性剂或去垢剂的溶液，超声0.5-3 h使质膜蛋白质溶解于溶液中。
8、本专利技术的有益效果是，常用的基于细胞表面蛋白标记的膜蛋白富集方法，受限于细胞表面可用功能基团不足，致使细胞膜表面引入富集靶标的效率有限，导致膜蛋白富集效率较低，本专利技术利用高效率的磷脂酶酶促标记和点击化学反应，对细胞膜表面大量分布的磷脂分子进行高效标记，以实现细胞膜表面高密度富集靶标的引入，利于细胞膜蛋白的完整捕获，从而提高膜蛋白的富集效率。
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1.一种基于磷脂酶酶促标记的细胞膜蛋白富集方法，其特征在于：所述的方法包括：在细胞膜表面修饰生物素，裂解细胞，基于生物素亲和素的亲和相互作用介导细胞膜表面结合亲和素-磁性纳米粒子，质膜蛋白纯化，质膜蛋白酶解和LC-MS/MS鉴定，其特征在于：所述细胞膜表面修饰生物素，通过磷脂酶酶促标记细胞膜磷脂双分子层，于细胞膜表面引入炔基；进一步利用炔-叠氮点击化学反应标记生物素，使细胞膜修饰上生物素。
2.根据权利要求1所述的基于磷脂酶酶促标记的细胞膜蛋白富集方法，其特征在于：所述的磷脂酶酶促标记细胞膜磷脂双分子层，标记方法如下：细胞刮下置于新鲜的完全培养液中，加入终浓度为36 mM 炔醇、2 mg/mL PLD酶及4 mM CaCl2，溶液吹打混匀，于条件为37℃、5% CO2的培养箱中反应1小时；
3.根据权利要求1所述的基于磷脂酶酶促标记的细胞膜蛋白富集方法，其特征在于：借助磷脂酶催化磷脂酰胆碱的转磷脂酰化反应机理，将含炔基的烷基醇引入细胞膜表面的磷脂双分子层（1-1），再通过炔-叠氮点击化学反应将生物素引入细胞膜表面（1-2），细胞裂解后（2），基于生物素与生
...【技术特征摘要】
1.一种基于磷脂酶酶促标记的细胞膜蛋白富集方法，其特征在于：所述的方法包括：在细胞膜表面修饰生物素，裂解细胞，基于生物素亲和素的亲和相互作用介导细胞膜表面结合亲和素-磁性纳米粒子，质膜蛋白纯化，质膜蛋白酶解和lc-ms/ms鉴定，其特征在于：所述细胞膜表面修饰生物素，通过磷脂酶酶促标记细胞膜磷脂双分子层，于细胞膜表面引入炔基；进一步利用炔-叠氮点击化学反应标记生物素，使细胞膜修饰上生物素。
2.根据权利要求1所述的基于磷脂酶酶促标记的细胞膜蛋白富集方法，其特征在于：所述的磷脂酶酶促标记细胞膜磷脂双分子层，标记方法如下：细胞刮下置于新鲜的完全培养液中，加入终浓度为36 mm 炔醇、2 mg/ml...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈玲凡，张淑玫，李郁梅，陈燕钦，
申请(专利权)人：福建医科大学，
类型：发明
国别省市：
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