一种基于EFIRM技术HPV病毒检测的探针组合、试剂盒以及方法技术

本发明专利技术公开了一种基于EFIRM技术HPV病毒检测的探针组合、试剂盒以及方法，涉及基因检测技术领域，其包括多个探针对，每个探针对包括用于结合目标序列的捕获探针和与捕获探针对应的且可结合目标序列的检测探针，检测探针的3’端或5’端标记有用于结合催化酶的亲和物。该探针组合能够对待测样本中的病毒进行基因型检测，具有较强的特异性、较高的灵敏度以及较低的假阳性率，且检出结果准确可靠。

Probe combination, kit and method for detecting HPV virus based on EFIRM Technology

The invention discloses a probe combination, EFIRM detection of HPV virus and kit based method, which relates to the technical field of genetic testing, which comprises a plurality of probes, each probe can be combined and used to include the target sequence detection probe and capture probe with the target sequence and capture probe corresponding to the 3 'end or 5' end labeled detection probe for binding affinity catalytic enzyme. The probe can be used to detect the genotype of the virus in the sample, which has strong specificity, high sensitivity and low false positive rate, and the detection results are accurate and reliable.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及基因检测
，具体而言，涉及一种基于EFIRM技术HPV病毒检测的探针组合、试剂盒以及方法。
技术介绍
宫颈癌是女性生殖道最常见的恶性肿瘤之一，已有研究表明，高危型人乳头瘤病毒(HumanPapillomavirus，HPV)持续感染及多重感染是导致宫颈癌变的重要原因之一，全球范围的研究结果显示，在99.7％的宫颈癌患者体内检测到高危型HPVDNA的存在。目前已经发现的HPV有200多种型别，主要包括低危型和高危型两大类。不同型别与不同疾病的相关性也不一样，低危型HPV感染可能会引起生殖道湿疣病变，高危型HPV感染则与宫颈癌、阴道癌相关。目前还缺乏针对HPV公认的有效治疗手段，因此宫颈HPV早发现、早预防是阻断癌变的关键。多年来，国际上通用的宫颈上皮内瘤变及宫颈癌的诊断主要遵循“三阶梯式”诊断程序，即宫颈细胞学、阴道镜及组织病理学检查。由于HPV不能体外培养，HPV检测方法主要基于HPVDNA的分子分型。HPV核酸检测技术主要包括杂交捕获法，PCR-荧光探针法、转录介导的核酸扩增技术以及PCR-杂交法等。宫颈癌的早期筛查方式是采用巴氏涂片以及改进后的TCT技术，这些方法只能从细胞学病变的角度来评估宫颈癌的发病情况，也就是说需要等到遭受病毒感染的细胞开始出现明显变化时才可以检测出来，特异性和灵敏度均不够理想。随着对HPV感染导致宫颈癌的认识加深以及分子诊断技术的发展，HPV基因检测作为宫颈癌的一种筛查手段得到了更广泛的应用。目前HPV分型检测技术主要基于聚合酶链反应，如荧光定量、反向斑点杂交和基因芯片技术等，这些技术表现出高灵敏度、高特异性，可以进行多重感染检测等优点，但这些技术对实验条件和检验人员素质要求高，检测费用也较高，不太适用于大量的临床检测和大规模的流行病学筛查。第二代基因杂交捕获技术检测采用美国Digene公司的HC2技术试剂盒，HC2是一种应用微孔板化学发光进行信号放大的核酸杂交检测方法，被公认为评价HPV检测新技术的金标准。然而，HC2检测方法价格昂贵，且其方法操作繁琐，操作过程中容易交叉污染而出现假阳性。
技术实现思路
本专利技术的第一目的在于提供一种基于EFIRM技术HPV病毒检测的探针组合，该探针组合能够对待测样本中的病毒进行基因型检测，具有较强的特异性、较高的灵敏度以及较低的假阳性率，且检出结果准确可靠。本专利技术的第二目的在于提供一种基于EFIRM技术HPV病毒检测的试剂盒，该试剂盒能够对待测样本中的病毒进行基因型检测，其具有较强的特异性和较高的灵敏度，且检出结果准确可靠、假阳性率低、操作简单方便。本专利技术的第三目的在于提供一种病毒基因分型检测的方法,该方法能够对待测样本中的病毒进行基因型检测，具有较强的特异性和较高的灵敏度，且检出结果准确可靠，检测方法简单易操作。本专利技术解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。一种基于EFIRM技术HPV病毒检测的探针组合，其包括多个探针对，每个探针对包括用于结合目标序列的捕获探针(CaptureProbe，CP)和与捕获探针相对应的且可结合目标序列的检测探针(DetectorProbe，DP)，每个探针对的检测探针的3’端或5’端标记有用于结合催化酶的亲和物，催化酶用于催化底物产生化学反应形成电子流，多个探针对包括：第1探针对、第2探针对、选自第12～16探针对中的至少一种；其中，第1探针对的捕获探针的碱基序列如SEQIDNO.1所示，第2探针对的捕获探针的碱基序列如SEQIDNO.3所示，所述第12～16探针对的捕获探针的碱基序列分别如SEQIDNO.20～24所示。一种基于EFIRM技术HPV病毒检测的试剂盒，其包括上述的基于EFIRM技术HPV病毒检测的探针组合。一种基于EFIRM技术HPV病毒检测的方法，其包括如下步骤：提供多个探针对，多个探针对包括：第1探针对、第2探针对以及选自第3～11探针对中的至少一种；每个探针对包括用于结合目标序列的捕获探针和与捕获探针相对应的且可结合目标序列的检测探针，检测探针的3’端或5’端标记有可用于结合用于催化相应底物产生化学反应形成电子流的催化酶的亲和物；先将用于结合目标序列的捕获探针通过电场作用固定至检测孔板的反应孔内；将待测样本加入至反应孔内；加入与捕获探针对应的且可结合目标序列的检测探针至反应孔内，检测探针的3’端或5’端标记有可用于结合用于催化相应底物产生化学反应形成电子流的催化酶的亲和物；加入催化酶和底物至反应孔内，通过电流检测装置检测反应孔内的电流；其中，第1探针对的捕获探针的碱基序列如SEQIDNO.1所示，第2探针对的捕获探针的碱基序列如SEQIDNO.3所示，第12～16探针对的捕获探针的碱基序列分别如SEQIDNO.20～24所示。本专利技术提供的基于EFIRM技术HPV病毒检测的探针、试剂盒以及方法的有益效果是：本专利技术提供的基于EFIRM技术HPV病毒检测的探针组合包括多个探针对，每个探针对包括有用于结合目标序列的捕获探针和与捕获探针相对应的且可结合目标序列的检测探针，捕获探针通过碱基互补原则与目标序列结合，将目标序列捕获固定，进行第一次特异性结合固定；检测探针通过碱基互补原则与目标序列第二特异性结合，检测探针被结合固定；检测探针的3’端或5’端的通过标记的亲和物将催化酶结合，催化酶催化底物释放电流信号，检测释放的电流信号，进而检测出病毒基因型。由于，目标序列只有与捕获探针和检测探针同时准确配对后即经过两次特异性结合，才能有信号的产生，这大大地提高了检测的特异性，使得检出结果准确可靠，假阳性率非常低。且本专利技术的提供了各探针对的捕获探针的碱基序列，其能够分别捕获固定例如常见型的HPV16亚型、18亚型以及中高危型的HPV26、53、66、73、82亚型中的目标序列，进而可检测出待测样本中是否含有常见型病毒例如HPV16亚型、18亚型以及高危型病毒例如HPVHPV26、53、66、73、82亚型中的一种或多种病毒亚型。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本专利技术的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。图1为本专利技术实施例1的检测结果；图2为本专利技术实施例2的检测结果；图3为本专利技术实施例3的检测结果；图4为本专利技术实施例4的检测结果；图5为本专利技术实施例5的检测结果；图6为本专利技术实施例6的检测结果。具体实施方式为使本专利技术实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。下面对本专利技术实施例的基于EFIRM技术HPV病毒检测的探针、试剂盒以及方法进行具体说明。通常来说，根据各种HPV亚型在宫颈癌患者出现的概率大小，一般情况下将上述人乳头瘤病毒(HumanPapillomavirus，HPV)作如下分类。HPV16、18亚型是临床最常见的，也是该两类型病毒在宫颈癌患者出现的概率最大；HPV31、33、52、58、35、39、45、51、5本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于EFIRM技术HPV病毒检测的探针组合，其特征在于，其包括多个探针对，每个所述探针对包括用于结合目标序列的捕获探针和与所述捕获探针相对应的且可结合所述目标序列的检测探针，每个所述探针对的检测探针的3’端或5’端标记有用于结合催化酶的亲和物，所述催化酶用于催化底物产生化学反应形成电子流，多个所述探针对包括：第1探针对、第2探针对以及选自第12～16探针对中的至少一种；其中，所述第1探针对的捕获探针的碱基序列如SEQ ID NO.1所示，所述第2探针对的捕获探针的碱基序列如SEQ ID NO.3所示，所述第12～16探针对的捕获探针的碱基序列分别如SEQ ID NO.20～24所示。

【技术特征摘要】
1.一种基于EFIRM技术HPV病毒检测的探针组合，其特征在于，其包括多个探针对，每个所述探针对包括用于结合目标序列的捕获探针和与所述捕获探针相对应的且可结合所述目标序列的检测探针，每个所述探针对的检测探针的3’端或5’端标记有用于结合催化酶的亲和物，所述催化酶用于催化底物产生化学反应形成电子流，多个所述探针对包括：第1探针对、第2探针对以及选自第12～16探针对中的至少一种；其中，所述第1探针对的捕获探针的碱基序列如SEQIDNO.1所示，所述第2探针对的捕获探针的碱基序列如SEQIDNO.3所示，所述第12～16探针对的捕获探针的碱基序列分别如SEQIDNO.20～24所示。2.根据权利要求1所述的基于EFIRM技术HPV病毒检测的探针组合，其特征在于，所述第12探针对的检测探针的碱基序列如SEQIDNO.26所示，所述第13探针对和所述第14探针对的检测探针的碱基序列如SEQIDNO.25所示，所述第15探针对的检测探针的碱基序列如SEQIDNO.27所示，所述第16探针对的检测探针的碱基序列如SEQIDNO.28所示。3.根据权利要求1或2所述的基于EFIRM技术HPV病毒检测的探针组合，其特征在于，多个所述探针对还包括选自第3～11探针对中的至少一种，所述第3～11探针对的捕获探针的碱基序列分别如SEQIDNO.5～13所示，所述第3探针对和所述第5探针对的检测探针的碱基序列如SEQIDNO.14所示，所述第4探针对的检测探针的碱基序列如SEQIDNO.15所示，所述第6探针对和所述第11探针对的检测探针的碱基序列如SEQIDNO.16所示，所述第7探针对的检测探针的碱基序列如SEQIDNO.17所示，所述第8探针对和所述第9探针对的检测探针的碱基序列如SEQIDNO.18所示，所述第10探针对的检测探针的碱基序列如SEQIDNO.19所示。4.一种基于EFIRM技术HPV病毒检测的试剂盒，其特征在于，其包括权利要求1～3中任一项所述的基于EFIRM技术HPV病毒检测的探针组合。5.根据权利要求4所述的基于EFIRM技术HPV病毒检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括用于将所述捕获探针固定至检测孔板的固定物，所述固定物包括导电聚合物和离子化合物；所述导电聚合物为选自吡咯、苯胺和噻吩中的任一种；所述离子化合物为选自氯化钠和氯化钾中的任一种。6.根据权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：廖玮，莫亚勤，林晓燕，张晨光，
申请(专利权)人：广州易活生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44