本发明专利技术公开了一种用于等温扩增检测寨卡病毒的核酸、实时荧光RPA试剂盒及其检测方法。本发明专利技术提供的试剂盒，使用方便，所用的试剂少，成本低，所需仪器的兼容性强，在实时荧光PCR仪和具有荧光捕获功能的仪器上均可以进行反应，其最大优势在于进行等温扩增并在10～30min内即可实时检测到荧光信号。检测方法大大简化了操作过程，减少了重复操作的步骤，节省时间，减轻重复操作消耗的劳动力，并有效节约成本，检测结果说明，其特异性强，灵敏度高，实现了寨卡病毒的快速、准确筛查。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物技术检测领域，具体涉及用于寨卡病毒检测的实时荧光RPA试剂盒及其检测方法。
技术介绍
寨卡病毒病也称寨卡热(Zikafever)，是由寨卡病毒(Zikavirus，ZIKV)引起并通过蚊媒传播的一种病毒性疾病。寨卡病毒于1947年首次在乌干达被发现，科学家们在用于黄热病监测的恒河猴体内分离到一种病毒，命名为“寨卡病毒”。1952年，乌干达及坦桑尼亚发现人感染寨卡病毒。随后仅有该病的零星报告或小规模流行。直至2007年，位于南太平洋地区密克罗尼西亚联邦雅浦岛发生寨卡病毒暴发流行，病毒由东南亚输入，也是首次发现寨卡病毒在亚非大陆以外传播。2013年，法属波利尼西亚发生寨卡病毒暴发。2015年以前，暴发疫情主要分布在非洲、东南亚和太平洋岛国。2015年5月，巴西发现首例确诊寨卡病例，泛美卫生组织(PAHO)发出警告，巴西政府估计有44-150万人感染寨卡病毒。随后，美洲多个国家相继发生寨卡病毒感染病例。迄今，全世界已有30多个国家报道寨卡病毒感染并引发多个国家输入性病例。近期有相关媒体报道中国台湾地区有输入性寨卡病毒感染病例报告，且有研究提示，寨卡病毒与新生儿小头畸形存在关联，并可通过性途径传播。我国和美洲地区有持续的经济贸易和旅游往来，且具备寨卡病毒传播蚊媒，存在病毒输入引发本地传播的风险。寨卡病毒属于黄病毒科黄病毒属，病毒颗粒呈球状，直径约为40-70nm。寨卡病毒为单股正链病毒，基因组长约10.8kb，含一条单一开放读码框，病毒蛋白由一个单一的多蛋白前体\经宿主蛋白酶和病毒蛋白酶切而成，包括3个结构蛋白(C、prM/M、E)和7个非结构蛋白(NS1NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5)，结构蛋白位于氨基端，非结构蛋白位于羧基段，具有丝氨酸蛋白酶、RNA解旋酶和RNA依赖RNA聚合酶(RdRP)功能。其中，衣壳蛋白和单股正链基RNA因组构成20面体对称的核衣壳，外层脂质包膜。寨卡病毒感染的实验室诊断主要依靠对发病5天内病人血液样本中病毒核酸的检测，包括病毒分离及RT-PCR扩增。一般发病后，5天内血液标本病毒分离率较高。可从病人全血、血清、血浆中分离病毒，用全血分离效率较高。将标本接种于蚊源细胞(C6/36)或哺乳动物细胞(BHK21、Vero)进行分离培养，乳鼠脑内接种、巨蚊胸内接种亦可用于病毒分离。出现病变以后，用检测抗原或核酸方法鉴定病毒。分离到寨卡病毒可以确诊。血清学试验，包括ELISA、免疫荧光、中和试验等，也被广泛应用于寨卡病毒的实验室检测。病毒特异性IgM和中和抗体出现较晚，约发病后1周末期可检出。在2007年雅浦岛寨卡病毒暴发流行时，美国疾病预防控制中心就已建立了检测寨卡病毒IgM特异性抗体的ELISA方法。但黄病毒间交叉反应常见，难以鉴别。有研究报道，寨卡病毒与登革病毒、黄热病毒、圣路易斯脑炎病毒等存在血清学交叉反应。此外，在感染早期，IgM和IgG抗体的滴度较低，难以确诊。空斑减少中和试验(PRNT)可检测病毒特异性中和抗体，可以区别黄病毒首次感染产生的抗体。目前尚没有检测寨卡病毒特异性抗体的商品化试剂。目前，检测寨卡病毒的核酸方法主要为实时荧光RT-PCR。尽管该方法的检测时间相比普通PCR方法有所缩短，但其还是基于变温进行的，因此对于仪器的要求较高。截止目前，还没有见到一种快速、不需要特殊设备也可获得较为可靠的结果的检测方法。重组酶聚合酶扩增技术(Recombinasepolymeraseamplifcation，RPA)是近年来发展起来的新型等温扩增技术，其原理是重组酶和引物形成复合物，当发现模板DNA与引物完全互补的序列的时，单链DNA结合蛋白对模板DNA进行解链，引物与模板DNA开始配对并在DNA聚合酶的作用下进行延伸反应，形成双链DNA产物；实时RPA则是在扩增体系中加入一个荧光标记的探针便可实现模板扩增的实时监测。但目前由于引物及探针的设计难度较大，一般较难达到理想的检测效果。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供了一组用于等温扩增检测寨卡病毒的核酸。本专利技术的另一个目的是提供一种用于检测寨卡病毒的实时荧光RPA试剂盒及其检测方法。本专利技术的检测方法不需要特殊的仪器即可获得检测结果，检测快速、成本低。为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：一组用于等温扩增检测寨卡病毒的核酸，包括用于寨卡病毒检测的上、下游引物和探针，其中，所述上游引物的序列如SEQIDNo.1所示，所述下游引物序列如SEQIDNo.2所示，所述探针的序列如SEQIDNo.3所示，其中，所述探针的第31位T碱基标记荧光基团，第32位T碱基标记荧光淬灭基团，所述第31位T碱基与所述第32位T碱基之间设有脱碱基位点，所述探针的3’端磷酸化设计。如上所述的核酸，优选地，所述荧光基团为FAM或TAMARA，所述淬灭基团为BHQ1或BHQ2；所述的脱碱基位点可替换为四氢呋喃；所述探针3’端的磷酸化设计可替换为连接C3-Spacer或biotin-TEG。如上所述的核酸，优选地，该组核酸还包括寨卡病毒检测的阳性扩增产物序列，所述寨卡病毒检测的阳性扩增产物序列包含如SEQIDNo.4所示的序列。一种用于检测寨卡病毒的实时荧光RPA试剂盒，该试剂盒包括：如上所述的核酸，逆转录酶、重组酶及DNA聚合酶混合液、2×重组反应液、醋酸镁溶液。如上所述的实时荧光RPA试剂盒，该试剂盒还包括20nm的纳米金溶液。一种用于检测寨卡病毒的实时荧光RPA方法，该方法是非诊断目的的检测方法，具体包括以下步骤：(1)从样品中提取RNA；(2)对步骤(1)提取的所述RNA进行等温扩增；其中，在反应体系中，采用如上所述寨卡病毒的上、下游引物及探针，置于40℃恒温反应；(3)在所述恒温反应进行5min后取出反应，进行上下颠换混匀反应液，然后放入继续进行反应25min，同时收集荧光信号；(4)结果判定：待测样品中有明显扩增曲线，则判断为阳性，如无明显扩增曲线，判断为阴性。如上所述的方法，优选地，所述步骤(2)中等温扩增的反应体系具体如下：反应总体积为50μL，其中，缓冲液为2×重组反应液，酶为逆转录酶、重组酶及DNA聚合酶混合液，所述寨卡病毒的上、下游引物的终浓度为0.42μmol/L，所述探针的终浓度为0.12μmol/L，所述样品的RNA为10μL，所述反应体系中需要在最后加入2.5μL浓度为280mM的醋酸镁溶液。如上所述的方法，优选地，所述反应体系还包括有20nm的纳米金，其终浓度为0.12μmol/L。如上所述的方法，优选地，同时设置无核酸酶水为阴性对照；采用包含如SEQIDNo.4所示的序列质粒作为阳性对照。本专利技术提供了一种用于等温扩增检测寨卡病毒的实时荧光RPA试剂盒，使用方便，操作简便，有效替代实时荧光RT-PCR来获得检测结果，且试剂盒所用的试剂少，成本低，并大大简化了操作过程，减少了重复操作的过程，也就减少了在操作过程的污染，避免重复操作而消耗过多的劳动力，节省时间，有效节约成本，实现了快速筛查，所用试剂盒的检测效果好，特异性强，灵敏度高。该实时荧光RPA试剂盒的用于检测寨卡病毒的反应时，所需仪器的兼容性强，在实时荧光PCR仪和具有荧光捕获功能的仪器上均可以进行反应，其最大优势在于本文档来自技高网...
【技术保护点】
一组用于等温扩增检测寨卡病毒的核酸，其特征在于，包括用于寨卡病毒检测的上、下游引物和探针，其中，所述上游引物的序列如SEQ ID No.1所示，所述下游引物序列如SEQ ID No.2所示，所述探针的序列如SEQ ID No.3所示，其中，所述探针的第31位T碱基标记荧光基团，第32位T碱基标记荧光淬灭基团，所述第31位T碱基与所述第32位T碱基之间设有脱碱基位点，所述探针的3’端磷酸化设计。
【技术特征摘要】
1.一组用于等温扩增检测寨卡病毒的核酸，其特征在于，包括用于寨卡病毒检测的上、下游引物和探针，其中，所述上游引物的序列如SEQIDNo.1所示，所述下游引物序列如SEQIDNo.2所示，所述探针的序列如SEQIDNo.3所示，其中，所述探针的第31位T碱基标记荧光基团，第32位T碱基标记荧光淬灭基团，所述第31位T碱基与所述第32位T碱基之间设有脱碱基位点，所述探针的3’端磷酸化设计。2.如权利要求1所述的核酸，其特征在于，所述荧光基团为FAM或TAMARA，所述淬灭基团为BHQ1或BHQ2；所述的脱碱基位点可替换为四氢呋喃；所述探针3’端的磷酸化设计可替换为连接C3-Spacer或biotin-TEG。3.如权利要求1所述的核酸，其特征在于，该组核酸还包括寨卡病毒检测的阳性扩增产物序列，所述寨卡病毒检测的阳性扩增产物序列包含如SEQIDNo.4所示的序列。4.一种用于检测寨卡病毒的实时荧光RPA试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括：如权利要求1-3中任一所述的核酸，逆转录酶、重组酶及DNA聚合酶混合液、2×重组反应液、醋酸镁溶液。5.如权利要求4所述的实时荧光RPA试剂盒，其特征在于，该试剂盒还包括20nm的纳米金溶液。6.一种用于检测寨卡病毒的实时荧光RPA方法，其特征在于，该...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨鹏飞，燕清丽，李兵兵，邢亚东，刘纯成，李双姝，胡锦流，姚海波，何南江，
申请(专利权)人：淮安市疾病预防控制中心，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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