用于分离和/或纯化核酸的裂解、结合和/或洗涤试剂制造技术

本发明专利技术提供了一种用于分离和/或纯化核酸的裂解、结合和/或洗涤试剂以及分离和/或纯化核酸的方法。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及用于分离和/或纯化核酸的裂解、结合和/或洗涤试剂及其方法。所述裂解、结合和/或洗涤试剂及方法尤其适用于分子诊断学目的。专利技术背景现有技术已经揭示了从细胞、细胞培养物或病毒培养物分离和/或纯化核酸如脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)的多种方法。在该方面，手动进行的用于分离核酸的许多“经典”方法是一步方法，包括在加入水性缓冲剂和有机萃取剂之后进行萃取。核酸保留在水相中，可在去除包含不良伴随物质的有机相之后分离得到。这些方法首先使用正常无害的有机萃取剂如氯仿或苯酚，然后水溶性污染物保留在包含核酸的水相中并且需要进一步的纯化步骤去除。因此，本领域的替代方法获得的重视，该方法基于使核酸选择性吸附到固体、主要是矿物支持体如二氧化硅上。结合原则是基于在“离液盐”和/或醇的影响下，核酸与二氧化硅表面的可逆结合。在多步方法中，将各种溶液或混合物，通常是裂解、结合、洗涤和/或洗脱溶液或混合物加入含核酸的样品中，并且在最后的方法步骤中，将纯化的核酸从在结合步骤中刚刚加入的支持体上洗脱下来。两种方法的基本原则基于在第一步中裂解的细胞，尤其是植物、动物、人、细菌和病毒细胞。为此，首先将细胞与破坏细胞的裂解缓冲液一起孵育。现有技术揭示了用于裂解生物样品细胞材料的缓冲剂和方法。已知的裂解缓冲剂常常包含表面活性剂聚氧乙烯脱水山梨醇单月桂酸酯(20)。使用该表面活性剂是为了将细胞裂解期间的污染转化为可溶或者稳定化状态，将它们从核酸中去除。不幸的是，包含聚氧乙烯脱水山梨醇单月桂酸酯(20)的裂解缓冲剂储存不稳定。例如，pH降低。一个具体的缺点在于，如果使用这些裂解缓冲剂，则储存后分离的核酸的产量降低。另一个缺点在于，包含核酸的洗脱液不透明，表明存在可能干扰分离核酸的进一步应用的污染。因此，本专利技术的目的是提供克服至少一种上述现有技术的缺点的方法，该方法具有尽可能优异或更好的裂解、结合和/或洗涤性质。如权利要求1所述的裂解、结合和/或洗涤试剂实现的本专利技术的目的。因此，提供了一种裂解、结合和/或洗涤试剂，其包含：-至少一种离液化合物，-至少一种缓冲化合物，优选选自：三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS)、N-(三(羟甲基)甲基)甘氨酸(TRICINE)、N,N-双(2-羟乙基)甘氨酸(BICINE)、N-(2-羟乙基)哌嗪-N’-(2-乙磺酸)(HEPES)、哌嗪-1,4-双(2-乙磺酸)(PIPES)、N-环己基-2-氨基乙磺酸(CHES)、2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)、3-(N-吗啉代)丙磺酸(MOPS)和/或磷酸盐缓冲剂，和-至少一种基于聚氧乙烯的非离子型表面活性剂，选自聚氧乙烯脂肪醇醚、聚氧乙烯烷基苯基醚和/或聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物，以试剂的总体积计，其用量从≥8％重量/体积到≤50％重量/体积。出于本专利技术的目的，术语“裂解、结合和/或洗涤试剂”表示裂解试剂、结合试剂或洗涤试剂的试剂，或者可用作裂解试剂也可用作结合试剂也可用作洗涤试剂的试剂。更具体说，出于本专利技术的目的，术语“裂解、结合和/或洗涤试剂”也可表示本专利技术的裂解试剂、结合试剂和/或洗涤试剂的混合物。出于本专利技术的目的，术语“试剂”表示裂解、结合和/或洗涤试剂。出于本专利技术的目的，术语“离液化合物”表示以变性方式作用于蛋白质的化合物，具体是破坏基于氢键形成的液态水的常规结构。出于本专利技术的目的，术语“缓冲化合物”表示可以为水溶液提供缓冲或pH稳定作用的化合物。出于本专利技术的目的，术语“磷酸盐缓冲剂”表示磷酸盐，例如磷酸二氢盐如磷酸二氢钾(KH2PO4)或磷酸二氢钠(NaH2PO4)，和磷酸氢盐如磷酸氢二钠(Na2HPO4·2H2O)或磷酸氢二钾。类似地，可使用磷酸盐的混合物。另一种常用的磷酸盐缓冲剂是包含氯化钠、Na2HPO4、氯化钾和KH2PO4的PBS(磷酸盐缓冲盐水)。出于本专利技术的目的，术语“核酸”表示但不限于：天然，优选分离的、线性、支化或环状核酸如RNA，具体是mRNA、siRNA、miRNA、snRNA、tRNA、hnRNA或核酶，DNA，质粒DNA等，合成或修饰的核酸，体外转录物，例如寡核苷酸，更具体是引物、探针或PCR可用的标准品，地高辛配基(digoxygenin)、生物素或荧光染料标记的核酸，甲基化核酸或“PNA”(“肽核酸”)。出于本专利技术的目的，术语“表面活性剂”表示界面活性和/或表面活性物质。出于本专利技术的目的，术语“脂肪醇”表示链长6-22个碳原子，优选8-20个碳原子，优选10-18个碳原子，更优选12-18个碳原子的醇。尤其优选具有12、14、16或18个碳原子的醇。虽然脂肪醇可以是单或多不饱和的，它们优选是饱和脂肪醇。出于本专利技术的目的，“聚氧乙烯”表示HO-(CH2CH2O)n单元，n优选是2-150的整数，更优选4-120，甚至更优选8-80，最优选是选自下组的整数：2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149和150。出于本专利技术的目的，“聚氧丙烯”表示HO-(CH2CH2CH2O)n单元，n优选是10-90的整数，更优选20-80，甚至更优选30-70，最优选n是选自下组的整数：10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89和90。出于本专利技术的目的，信息“％重量/体积”、“％(重量/体积)”或“％(w/v)”表示例如每100毫升的试剂或组合物中表面活性剂的克数的信息。意外地，发现本专利技术的裂解、结合和/或洗涤试剂在储存期间具有改良的稳定性。因此，例如，本专利技术的裂解、结合和/或洗涤试剂在室温下储存3个月，优选6个月，更优选至少8个月具本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种裂解、结合和/或洗涤试剂，其包含：‑至少一种离液化合物，‑至少一种缓冲化合物，优选选自：三(羟甲基)氨基甲烷、N‑(三(羟甲基)甲基)甘氨酸、N,N‑双(2‑羟乙基)甘氨酸、3‑(N‑吗啉代)丙磺酸、N‑(2‑羟乙基)哌嗪‑N’‑(2‑乙磺酸)、哌嗪‑1,4‑双(2‑乙磺酸)、N‑环己基‑2‑氨基乙磺酸、2‑(N‑吗啉代)乙磺酸和/或磷酸盐缓冲剂，和‑至少一种基于聚氧乙烯的非离子型表面活性剂，选自聚氧乙烯脂肪醇醚、聚氧乙烯烷基苯基醚和/或聚氧乙烯‑聚氧丙烯嵌段共聚物，以所述试剂的总体积计，其用量从≥8％重量/体积到≤50％重量/体积。

【技术特征摘要】
2008.05.30 DE 102008026058.41.一种裂解、结合和/或洗涤试剂，其包含：-至少一种离液化合物，-至少一种缓冲化合物，优选选自：三(羟甲基)氨基甲烷、N-(三(羟甲基)甲基)甘氨酸、N,N-双(2-羟乙基)甘氨酸、3-(N-吗啉代)丙磺酸、N-(2-羟乙基)哌嗪-N’-(2-乙磺酸)、哌嗪-1,4-双(2-乙磺酸)、N-环己基-2-氨基乙磺酸、2-(N-吗啉代)乙磺酸和/或磷酸盐缓冲剂，和-至少一种基于聚氧乙烯的非离子型表面活性剂，选自聚氧乙烯脂肪醇醚、聚氧乙烯烷基苯基醚和/或聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物，以所述试剂的总体积计，其用量从≥8％重量/体积到≤50％重量/体积。2.如权利要求1所述的裂解、结合和/或洗涤试剂，其特征在于，所述聚氧乙烯脂肪醇醚包含具有6-22个碳原子的脂肪醇部分和具有2-150个(CH2CH2O)单元的聚氧乙烯部分，其中，所述聚氧乙烯脂肪醇醚优选选自：聚氧乙烯月桂基醚、聚氧乙烯鲸蜡基醚、聚氧乙烯硬脂基醚和/或聚氧乙烯油基醚。3.如权利要求1或2所述的裂解、结合和/或洗涤试剂，其特征在于，所述聚氧乙烯脂肪醇醚不是聚氧乙烯月桂基醚。4.如前述权利要求中任一项所述的裂解、结合和/或洗涤试剂，其特征在于，所述聚氧乙烯烷基苯基醚选自：聚氧乙烯壬基苯基醚和/或聚氧乙烯异辛基苯基醚。5.如前述权利要求中任一项所述的裂解、结合和/或洗涤试剂，其特征在于，所述裂解、结合和/或洗涤试剂包含非离子型表面活性剂，以所述试剂的总体积计，其用量从≥9％重量/体积至≤40％重量/体积，优选≥10％重量/体积至≤30％重量/体积，优选≥15％重量/体积至≤20％重量/体积。6.如前述权利要求中任一项所述裂解、结合和/或洗涤试剂，其特征在于，所述离液化合物是钠盐或胍盐，优选选自：碘化钠、高氯酸钠、盐酸胍、硫氰酸胍、异硫氰酸胍和/或其中两种或更多种盐的混合物。7.如前述权利要求中任一项所述的裂解、结合和/或洗涤试剂，其特征在于，所述结合试剂包含支化或非支化的链烷醇，优选具有1-5个碳原子的支化或非支化的醇，优选选自：甲醇、乙醇、异丙醇、正丙醇、正丁醇、支化或非支化丁醇或戊醇和/或它们的混合物。8.如前述权利要求中...

【专利技术属性】
技术研发人员：R·法比斯，A·霍曼维施沁斯基，T·沃斯，T·汉斯勒，
申请(专利权)人：恰根有限公司，
类型：发明
国别省市：德国;DE