分离多聚(A)核酸的方法技术

本发明专利技术尤其涉及一种从含有核酸的样品中分离具有单链多聚(A)延伸段的多聚(A)核酸的方法，包括：(a)提供杂交组合物，其包含：i)含有核酸的样品；ii)杂交溶液，其包含：aa.钠盐；bb.季铵盐；其中杂交溶液的组分可以作为单一溶液加入到样品中或者可以以任何顺序分别加入到样品中；iii)能够与多聚(A)核酸的多聚(A)延伸段杂交的捕获探针；和将所述杂交组合物在所述多聚(A)核酸和所述捕获探针之间形成核酸杂交体的条件下进行孵育；(b)将形成的杂交体与剩余的样品分离。所述方法特别适用于从不同样品中有效地分离多聚(A)RNA，同时避免了不需要的非多聚(A)核酸(例如rRNA)的残留。本发明专利技术还提供了有益的方法、杂交溶液和试剂盒。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】专利
本专利技术提供了一种从含有核酸的样品中分离多聚(A)核酸的方法。所述方法有效地富集了多聚(A)核酸例如多聚(A)RNA而去除了不需要的非多聚(A)核酸、例如rRNA。所述方法特别适合于制备用于下一代测序(NGS)应用的多聚(A)RNA。此外、还提供了适用于执行本专利技术方法的组合物和试剂盒。专利技术背景本公开涉及聚腺苷酸化核酸、特别是多聚(A)RNA的分离。多聚腺苷酸化通常指的是向生物分子中添加由多个(通常几十到几百个)连续腺嘌呤(A)残基组成的延伸段、其中所述延伸段通常存位于分子的3’末端、通常称为“多聚(A)尾”。含有各自的多聚(A)延伸段或多聚(A)尾的核酸通常称为“多聚(A)核酸”。在真核生物中、聚腺苷酸化是与用于基因表达(翻译)的成熟信使RNA(mRNA)的产生相关的过程。在此、在转录(核聚腺苷酸化)结束时、将多聚(A)尾加入RNA中。在真核生物中、几乎所有的mRNA在3’末端具有多聚(A)尾、只有少数例外、如动物复制依赖性组蛋白mRNA(参见如Lopez等人(RNA14(1)：1-10,2007))。此外、除了绝大多数mRNA之外、各种真核非编码RNA也是多聚腺苷酸化的。这还包括一些小RNA、例如微小RNA、其在微小RNA成熟期间可以具有其中间形式的多聚(A)尾。此外、核酸也可以进行人工聚腺苷酸化从而为它们提供多聚(A)尾。核酸的多聚(A)尾已经作为从不同样品类型中分离多聚(A)核酸的手段、尤其是用于将多聚(A)核酸与没有多聚(A)尾的核酸分离、在本文中也称为“非多聚(A)核酸”。可以借助于能够与单链多聚(A)延伸段杂交的探针来分离多聚(A)核酸。这样的探针可以通过与多聚(A)延伸段杂交而捕获多聚(A)核酸、下文中也称为捕获探针。通常、采用一种寡核苷酸用于该目的、所述寡核苷酸含有与多聚(A)核酸的多聚(A)延伸段互补的序列、本文也称为捕获寡核苷酸。为了简化捕获的多聚(A)核酸的分离过程、通常采用的是经捕获探针功能化的固体支持物。用于从总RNA中特异性分离多聚(A)RNA的标准方式是基于Aviv和Leder(1972)的方法。这里、将互补DNA寡核苷酸(“寡聚dT”,“oligodT”)的短延伸段固定到不溶性基质、然后通过建立有利于形成RNA-DNA双链的条件将其用作多聚(A)RNA的选择性固定基质。将总RNA样品上样到具有合适的盐缓冲液(最初为含有0.5MKCl的10mMTris、pH7.5)的柱上、促使捕获探针与多聚(A)尾杂交。然后用应用缓冲液(含0.5MKCl)、再用低离子强度溶液(0.1MKCl)彻底对柱进行洗涤、接着用10mMTris(pH7.5)洗脱mRNA。对该原始方法的后续修饰保留了与固定化寡聚-dT杂交的基本过程、但是已经改变了例如、从柱到批量程序的形式、以允许更快地进行该程序并且已经使用NaCl或LiCl作为盐。进一步的变化是用塑料或玻璃珠作为固相以代替纤维素、并且采用磁珠作为固体支持物。这种磁性的质量允许这样的磁珠借助于磁体进行批量分离。此外、已经采用生物素-链霉亲和素连接来建立寡聚-dT与固体支持物之间的连接、其中寡核苷酸是经生物素化的、并且所述固体支持物共价偶联于链霉亲和素。杂交可以在溶液中进行、在后续步骤中将寡聚-dT-mRNA杂交体连接到固体支持物上。该方法倾向于一种在去除rRNA的同时选择性分离多聚(A)RNA的低效方法。rRNA残留水平通常高到足以提供与总RNA相同的问题、特别是对于罕见转录物的分析。其他多聚(A)核酸的分离方法旨在通过使用低离子强度(高严格性)洗涤来增强扩展的A：T杂交体中的相互作用、并试图找到更多的“惰性”材料用作支持物。等效稳定剂(Isostabilizingagents)、例如、按适合浓度使用时、属于四甲基铵(TMA+)和四乙基铵(TEA+)离子一类的季铵盐和甘氨酸氨基酸衍生物甜菜碱、可平衡A：T和G：C碱基对的氢键结合强度(Jacobs等人、1988；Jacobs等人、1985；Gitschier等人、1986；Melchior等人、1973；Rees等人、1993；Wood等人、1985；WoZney、1990)。在本领域中使用这种等效稳定剂以促进多聚(A)分离。US6,812,341描述了一种富集多聚(A)的方法、其目的在于通过使用等效稳定剂如四甲基铵(TMA+)和四乙铵(TEA+)离子、优选TMAC或TEAC、从而在分离过程中去除rRNA残留。WO90/12116涉及一种通用方法、其中将包被寡聚-dT的磁性颗粒用于多聚(A)RNA的分离。这里、四烷基铵阳离子与离液盐(chaotropicsalt)联合用于稳定多聚(A)核酸的多聚(A)尾部与寡聚(dT)探针之间的A：T键。此外、各种商业产品可用于多聚(A)核酸分离、例如DirectM48试剂盒、其采用了固定在磁珠上的寡聚(dt)捕获寡核苷酸、或用于分离多聚(A)RNA的mRNA试剂盒(凯杰)、其采用了固定于聚苯乙烯-乳胶珠(作为固体支持物)的寡聚(dT)捕获寡核苷酸。对于有效的多聚(A)核酸分离方法(即有效地捕获多聚(A)核酸、同时去除非多聚(A)核酸)仍有大量的需求。这些方法例如、提供适用于采用大规模并行方式进行的下一代测序(NGS)应用的多聚(A)RNA需求。NGS技术平台的共同之处在于它们需要制备适合大规模并行测序的测序文库。大多数平台在仪器上“运行”之前都遵循一个通用的库准备程序、而只有少许修改。这个程序包括片段化DNA、其可以从cDNA获得、随后是DNA修复和末端精加工(平端或A突出端)、最后、通常是平台特异性衔接子的连接。此类测序文库的制备和设计描述于例如Voelkerding等(ClinicalChemistry55：4641-658,2009)和Metzker(NatureReviews/GeneticsVolume11、2010年1月、第31-46页)中。NGS也已经用于转录组测序。使用下一代测序技术对整个转录组的研究提供了转录组详细、高通量的视图。转录组测序也称为RNA测序(RNA-seq)、并且例如、用于对生物样品中的转录物进行绘制和定量。该技术已经在诸如癌症的疾病研究中被快速采用。从多聚(A)RNA制备测序文库具有以下优点：不携带多聚(A)尾的RNA种类、例如rRNA(为不感兴趣的)在理论上不被回收、因此不被携带到测序反应。因此、从使用多聚(A)RNA产生的测序文库中获得的大多数序列对应于编码蛋白质的mRNA、其携带多聚(A)尾。然而、在真核细胞中、仅约1至5％的总RNA由初级转录物即聚腺苷酸化的mRNA组成、而核糖体RNA(rRNA)构成了本RNA种类的约90％。因此、即使当从多聚(A)RNA开始时、转录组测序的一个主要问题是干扰RNA分子的存在、特别是如果多聚(A)RNA起始材料不具有足够的纯度并且含有非多聚(A)污染。如果大量的rRNA参与文库构建、测序功能将用于对这些普遍存在的分子进行测序。高丰度的rRNA可能在测序读取中占主导地位、从而阻碍低表达基因的研究并浪费宝贵的测序资源。此外、核糖体RNA的存在可能导致低的信噪比、其可以导致难以检测感兴趣的RNA种类。因此、在分离多聚(A)RNA过程中对去除rRNA和/或其它不需要的非本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种从含有核酸的样品中分离具有单链多聚(A)延伸段的多聚(A)核酸的方法，包括：(a)提供杂交组合物，其包含：i)含有核酸的样品；ii)杂交溶液，其包含：aa.钠盐；bb.季铵盐；其中杂交溶液的组分可以作为单一溶液加入到样品中或者可以以任何顺序分别加入到样品中；iii)能够与多聚(A)核酸的多聚(A)延伸段杂交的捕获探针；和将所述杂交组合物在所述多聚(A)核酸和所述捕获探针之间形成核酸杂交体的条件下进行孵育；(b)将形成的杂交体与剩余的样品分离。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.04.30 EP 14166712.11.一种从含有核酸的样品中分离具有单链多聚(A)延伸段的多聚(A)核酸的方法，包括：(a)提供杂交组合物，其包含：i)含有核酸的样品；ii)杂交溶液，其包含：aa.钠盐；bb.季铵盐；其中杂交溶液的组分可以作为单一溶液加入到样品中或者可以以任何顺序分别加入到样品中；iii)能够与多聚(A)核酸的多聚(A)延伸段杂交的捕获探针；和将所述杂交组合物在所述多聚(A)核酸和所述捕获探针之间形成核酸杂交体的条件下进行孵育；(b)将形成的杂交体与剩余的样品分离。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，a)所述杂交组合物包含浓度≤250mM的杂交溶液钠盐，优选地，浓度选自：25mM-250mM、35mM-200mM、40mM-175mM、50mM-150mM、55mM-125mM、60mM-115mM和60mM-100mM；和/或b)所述杂交溶液包含浓度≤500mM的钠盐，优选地，浓度选自：50mM-500mM、75mM-400mM、85mM-350mM、100mM-300mM、115mM-250mM、120mM-225mM和125mM-200mM。3.如权利要求1或2所述的方法，所述季铵盐是四烷基铵盐，优选地，选自四甲基铵盐(TMA)和四乙基铵盐(TEA)。4.如权利要求3所述的方法，具有一种或多种以下特征：a)所述杂交组合物含有的杂交溶液四烷基铵盐浓度≤1.5M，优选地，浓度选自0.1M-1.75M、0.125M-1.5M、0.25M-1.25M、0.375M-1M和0.375M-0.75M；和/或b)所述杂交溶液含有的四烷基铵盐浓度≤3M，优选地，浓度选自0.2M-2.5M、0.5M-2M和0.75M-1.5M；和/或c)所述四烷基季铵盐选自下组：四乙基氯化铵(TEAC)、四甲基氯化铵(TMAC)、四甲基硝酸铵(TMAN)、四乙基溴化铵(TEAB)和四甲基溴化铵(TMAB)；和/或d)其中，所述四烷基铵盐优选为四甲基溴化铵。5.如权利要求1-4所述的一种或多种方法，包括：(a)提供杂交组合物，其包含：i)含有核酸的样品；ii)杂交溶液，其包含：aa.钠盐，浓度≤500mM；bb.作为季铵盐的四烷基铵盐；其中杂交溶液的组分可以作为单一溶液加入到样品中或者可以以任何顺序分别加入到样品中；iii)能够与多聚(A)核酸的多聚(A)延伸段杂交的捕获探针；其中所述杂交组合物含有的杂交溶液钠盐的浓度≤250mM，和将所述杂交组合物在所述多聚(A)核酸和所述捕获探针之间形成核酸杂交体的条件下进行孵育；(b)将形成的杂交体与剩余的样品分离。6.如权利要求1-5所述的一种或多种方法，包括(a)提供杂交组合物，其包含：i)含有核酸的样品；ii)杂交溶液，其包含：aa.钠盐，浓度选自50mM-350mM、75mM-300mM、100mM-250mM和125mM-200mM；bb.作为季铵盐的四烷基铵盐，浓度选自0.2M-2.5M、0.5M-2M和0.75M-1.5M；其中，所述杂交溶液的组分可以作为单一溶液加入样品或者可以以任何顺序分别加入样品；iii)能够与多聚(A)核酸的多聚(A)延伸段杂交的捕获探针；其中所述杂交组合物含有的杂交溶液钠盐的浓度选自25mM-175mM、37.5mM-150mM、50mM-125mM和62.5mM-100mM；且所述的四烷基铵盐的浓度选自0.1M-1.25M，0.25M-1M和0.375M-0.75M；和将所述杂交组合物在所述多聚(A)核酸和所述捕获探针之间形成核酸杂交体的条件下进行孵育；(b)将形成的杂交体与剩余的样品分离。7.如权利要求1-6所述的一种或多种方法，尤其是权利要求5或6，其特征在于，所述多聚(A)核酸是多聚(A)RNA，且优选地，所述含有核酸的样品是总RNA。8.如权利要求1-7所述的一种或多种方法，尤其是权利要求5或7，其特征在于，所述钠盐是氯化钠。9.如权利要求8所述的方法，用于从总RNA样本中分离多聚(A)RNA，包括：(a)提供杂交组合物，其包含：i)含有核酸的样品；ii)杂交溶液，其包含：aa.钠盐即氯化钠，浓度选自75mM-250mM、100mM-200mM、和125mM-175mM；bb.选自下组的四烷基铵盐作为季铵盐：四乙基氯化铵(TEAC)、四甲基氯化铵(TMAC)、四甲基硝酸铵(TMAN)、四乙基溴化铵(TEAB)和四甲基溴化铵(TMAB)，浓度选自0.2M-2.5M、0.5M-2M和0.75M-1.5M；其中，所述杂交溶液的组分可以作为单一溶液加入样品或者可以以任何顺序分别加入样品；iii)能够与多聚(A)核酸的多聚(A)延伸段杂交的捕获探针，其中所述捕获探针固定于固体支持物上；其中所述杂交组合物含有的杂交溶液钠盐的浓度选自37.5mM-125mM、50mM-100mM和62.5mM-87.5mM；且所述的四烷基铵盐的浓度选自0.125M-1.25M、0.5M-1M和0.375M-0.75M，和将所述杂交组合物在所述多聚(A)核酸和所述捕获探针之间形成核酸...

【专利技术属性】
技术研发人员：G·克里斯托费尔，M·施伦普博格，D·奥尼尔，
申请(专利权)人：凯杰有限公司，
类型：发明
国别省市：德国;DE