胞外核酸的固定和分离制造技术

本发明专利技术提供采用聚氧乙烯聚合物或乙二醇作为固定剂固定含细胞生物样本中的胞外核酸群的方法、组合物和装置。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本技术涉及用于固定(stablize)含细胞样本，尤其是血液样本中胞外核酸群的方法和组合物，并涉及用于从相应固定的生物样本中分离胞外核酸的方法。
技术介绍
已经于血液，血浆，血清和其它体液内鉴定出胞外核酸。由于它们免受核酸酶破坏的事实(例如，由于它们以蛋白脂质复合物的形式被分泌，与蛋白质结合或包含在囊泡内)，各样本中发现的胞外核酸在一定程度上难降解。在许多医疗条件、恶性肿瘤和感染过程中水平升高的胞外核酸如DNA和/或RNA的存在受到特别关注，用于筛选，诊断，预后，监测疾病进展，用于识别潜在的治疗目标，并用于监测治疗反应。另外，母体血液中升高的胎儿DNA/RNA用于，例如性别鉴定、评估染色体异常和监控妊娠相关的并发症。因此，胞外核酸在非侵入性诊断和预后中是特别有用的，并可以在许多应用领域，如非侵入产前遗传检测、肿瘤、移植医学或许多其他疾病中用作，例如诊断标志物，并因此是诊断相关的(例如来自胎儿或肿瘤的核酸)。但是，在健康人类中也发现了胞外核酸。胞外核酸的常规应用和分析方法描述于，例如WO97/035589；WO97/34015；Swarup等,FEBS Letters 581(2007)795-799；Fleischhacker Ann.N.Y.Acad.Sci.1075:40-49(2006)；Fleischhacker和Schmidt,生物化学和生物物理学学报(Biochmica et Biophysica Acta),1775,(2007),191-232；Hromadnikova等(2006)DNA和细胞生物学(DNA and Cell biology),25卷,11期,635-640页；Fan等(2010),临床化学(Clinical Chemistry),56:8中。胞外核酸通常仅以低浓度包含在样本中。例如，游离循环的核酸以1-100ng/ml血浆的浓度存在于血浆中。此外，胞外核酸经常以500nt、300nt(当表示大小和由此的链长时，术语“nt”也还包括“bp”，在DNA情况下)或甚至更小(循环核小体)的片段循环。对于血浆中的ccfDNA，平均长度通常仅为约140-170bp。另外，假设被识别用于诊断目的的实际目标胞外核酸通常也仅代表一小部分总胞外核酸。对于ccfDNA，通常只有几千份可扩增拷贝存在于每毫升血液中，取决于例如怀孕状态或肿瘤分级。特别地，肿瘤特异性DNA片段是非常罕见的，所含浓度经常比“正常”胞外核酸背景少1000倍。这种低浓度给样本的固定和随后从固定样本分离胞外核酸带来了挑战。除了在血清，也可能在血浆中发生的降解外，分析来自例如肿瘤或有关胎儿起源的循环、无细胞核酸(cfNA)的主要问题是样本采集后来自受损或破坏的细胞的遗传物质可能稀释胞外DNA(和RNA)。收集样本后，由于离体孵育期间，特别是样本收集后相对较短的时间内细胞破碎，细胞核酸从样本中含有的细胞释放。一旦细胞裂解开始，裂解的细胞释放大量其他的核酸，它们与胞外核酸混合，且变得越来越难以回收胞外核酸用于检测。对于血液样本，特别是白血细胞的裂解是问题，因为它们释放大量基因组DNA和RNA。红血细胞不含有基因组DNA。因此，固定全血中循环的核酸必须包括固定血细胞的机制，以便防止固定期间胞外核酸群被细胞基因组DNA和RNA污染。尤其是胞外核酸，特别是罕见目标的胞外核酸的稀释是问题，必须被阻止。这些问题在现有技术中讨论(参见例如Chiu等(2001),临床化学(Clinical Chemistry)47:9 1607-1613；Fan等(2010)和US2010/0184069)。此外，由于降解，可用胞外核酸的量和可回收利用性可在一段时间实质上减少。除了来自如肿瘤细胞或胎儿的哺乳动物胞外核酸，含细胞样本也可能包括其他受关注的核酸，它们没包含在细胞内。重要的、非限制的实例是病原体核酸，如病毒核酸。在运输和处理过程中含细胞样本如特别是血液标本中病毒核酸完整性的保护，对于随后的分析和病毒载量监测也是至关重要的。样本收集后，胞内核酸的释放尤其是问题，如果样本包含大量细胞，例如与全血样本情况一样。因此，为了避免分别减少上述问题，通常的做法是获得样本之后基本上立即从包含在样本中的细胞分离样本的基本无细胞部分。例如，建议抽血后基本上立即从全血获得血浆和/或冷却该全血和/或所获得的血浆或血清，以维持胞外核酸的完整性，并避免胞外核酸群被从包含细胞释放的胞内核酸污染。但是，获得样本的基本无细胞部分是有问题的，分离经常是冗长耗时的多步骤的过程，因为采用仔细控制的条件防止离心期间细胞破碎(破碎过程中释放的细胞核酸能够污染胞外核酸)是重要的。至于样本处理，需要从血液直接分离如血浆也是主要缺陷，因为合适的设备在收集样本的部位不一定可用。此外，经常难以除去所有的细胞。因此，通常和一般归为“无细胞”的许多处理的样本，如血浆或血清实际仍含有在分离过程中没有去除的残余量细胞。在样本处理过程中这些细胞也可能被破坏或可能死亡，从而释放胞内核酸，特别是基因组DNA，如上所述。这些残留细胞也带来风险，在处理期间它们被破坏，使它们的核酸成分，特别是基因组(核)DNA和细胞质RNA，将与胞外循环核酸部分合并从而将它们分别污染稀释。为去除这些残留细胞以及避免/减少上述问题，众所周知以较高速度执行第二离心步骤。然而，再次，这样强大的离心机往往在获得血液的设施无法使用。此外，即使抽血后直接得到血浆，如果不能直接分离核酸，建议在-80℃冷冻以保存其内包含的核酸。这也给必须冷冻运输的样本如血浆样本的处理强加实际限制。这增加成本，而且在冷链被中断的情况下存在样本被破坏的风险。对于血液固定化，以下技术是本领域中已知的：血液样本通常收集在含有喷雾干燥或液体EDTA(如BD真空采血管(Vacutainer)K2EDTA)的血液收集管内。EDTA螯合镁，钙和其它二价金属离子，从而抑制酶反应，如例如血液凝结或由于DNA酶的DNA降解。然而，EDTA不能有效防止储存期间胞外核酸群被释放的胞内核酸分别地稀释污染。因此，EDTA固定样本的无细胞部分中发现的胞外核酸群在储存期间改变，且被大量胞内核酸，特别是基因组DNA污染。因此，特别地，EDTA不能充分固定胞外细胞群，因为它不能避免胞外细胞群被如取血后由细胞降解和样本运输和存储期间细胞不稳定产生的基因组DNA片段污染。已知血液收集管包含用于在样本收集点直接固定RNA基因表达谱和由此的转录组的试剂(参见例如US 6,617,170、US 7,270,953、Kruhoffer等,2007)。但是，这些方法是基于包含在样本中的细胞的立即裂解。因此，这些方法和诱导细胞裂解的其他方法不适合固定含细胞样本中的胞外核酸群，因此它们诱导胞内核酸释放，从而与胞外核酸群混合。此外，现有技术已知用于固定含细胞样本，如血液或组织样本的方法，其固定如细胞、转录组、基因组和蛋白质组。这样的方法在如WO 2008/145710中公开。所述方法基于使用特定固定化合物，如，例如N,N-二甲基乙酰胺。但是N,N-二甲基乙酰胺是有毒试剂。因此，需要提供避免使用有毒试剂的其他固定方法。专门着眼于固定包含在全血中的胞外核酸的方法在现有技术中是已知的。一本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于固定包含在含细胞生物样本中的胞外核酸群的方法，包括将所述含细胞生物样本与作为固定剂的至少一种聚氧乙烯聚合物或作为固定剂的乙二醇接触的步骤。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.03.18 EP 14000990.3;2014.03.18 US 61/955,2001.一种用于固定包含在含细胞生物样本中的胞外核酸群的方法，包括将所述含细胞生物样本与作为固定剂的至少一种聚氧乙烯聚合物或作为固定剂的乙二醇接触的步骤。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述聚氧乙烯聚合物为聚乙二醇。3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述聚氧乙烯聚合物为分子量至少1500的高分子量聚氧乙烯聚合物。4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述高分子量聚氧乙烯聚合物的分子量在选自下组的范围内：1500-50000、2000-40000、2500-30000、2500-25000、3000–20000和3500–15000。5.如权利要求3或4所述的方法，其特征在于，在所述含细胞生物样本与所述高分子量聚氧乙烯聚合物以及任选的用于固定的其他助剂接触后，得到的混合物包括浓度范围选自下组的高分子量聚氧乙烯聚合物：0.05％-4％(w/v)、0.1％-3％(w/v)、0.2％-2.5％(w/v)、0.25％-2％(w/v)、0.3％-1.75％(w/v)和0.35％-1.5％(w/v)，或选自下组：0.25％-1.5％(w/v)、0.3％-1.25％(w/v)、0.35％-1％(w/v)和0.4％-0.75％(w/v)。6.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述聚氧乙烯聚合物的分子量低于1500，优选为分子量为1000或更低的低分子量聚氧乙烯聚合物。7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述聚氧乙烯聚合物为分子量为1000或更低的低分子量聚氧乙烯聚合物，且优选地，分子量在选自下组的范围：100-800、150-700、200–600和200–500。8.如权利要求6或7所述的方法，其特征在于，在所述含细胞生物样本与所述聚氧乙烯聚合物以及任选的用于固定的其他助剂接触后，得到的混合物包括聚氧乙烯聚合物，如分子量为1000或更低的低分子量聚氧乙烯聚合物，浓度范围选自下组：0.5％-10％、1.5％-9％、2％-8％、2-7％、2.5％-7％和3％-6％。9.如权利要求3-8中一项或多项所述的方法，其特征在于，所述含细胞生物样本与分子量至少1500的高分子量聚氧乙烯聚合物和分子量为1000或更低的低分子量聚氧乙烯聚合物接触。10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，在所述含细胞生物样本与所述高分子量聚氧乙烯聚合物以及任选的用于固定的其他助剂接触后，得到的混合物包括：-高分子量聚氧乙烯聚合物，浓度范围选自下组：0.1％-3％(w/v)、0.2％-2.5％(w/v)、0.25％-2％(w/v)、0.3％-1.75％(w/v)和0.35％-1.5％(w/v)；或选自下组：0.25％-1.5％(w/v)、0.3％-1.25％(w/v)、0.35％-1％(w/v)和0.4％-0.75％(w/v)；和-低分子量聚氧乙烯聚合物，浓度范围选自下组：0.5％-10％、1.5％-9％、1.75％-8％、2％-7％和2.5％-6％。11.如权利要求1-10中一项或多项所述的方法，其特征在于，所述含细胞生物样本为血液，且其中所述血液样本还与抗凝剂，优选螯合剂接触。12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述血液样本与高分子量聚氧乙烯聚合物、低分子量聚氧乙烯聚合物和抗凝剂接触，其中，所述高分子量聚氧乙烯聚合物分子量处于选自下组的范围：3000-40000、2500–25000和4000–20000；所述低分子量聚氧乙烯聚合物分子量处于选自下组的范围：200-800、200–600和200–500，其中，在所述血液样本与所述高和低分子量聚氧乙烯聚合物、抗凝剂以及任选的用于固定的其他助剂接触后，得到的混合物包括浓度范围为2％-7％，优选为2.25％-6％的低分子量聚氧乙烯聚合物和浓度范围选自下组的高分子量聚氧乙烯聚合物：0.2％-1.5％(w/v)、0.3％-1.25％(w/v)和0.4(w/v)-0.75％(w/v)。13.如权利要求1-12中一项或多项所述的方法，其特征在于，为固定，所述包含细胞的样本还与作为固定剂的至少一种半胱天冬酶抑制剂和/或一种或多种伯、仲或叔酰胺接触。14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述伯、仲或叔酰胺为式1所示的化合物其中，R1是氢或烷基，优选为C1-C5烷基、C1-C4烷基或C1-C3烷基，更优选C1-C2烷基；R2和R3相同或不同，选自氢和烃基，优选烷基，具有1-20个原子的碳链长度，以直链或支链形式；和R4是氧、硫或硒，优选地R4是氧。15.如权利要求1-14中一项或多项所述的方法，其特征在于，所述包含细胞的样本与丁酰胺和/或N,N-二烷基丙酰胺接触，其中所述N,N-二烷基丙酰胺优选为N,N-二甲基丙酰胺。16.如权利要求1-15中一项或多项所述的方法，其特征在于，所述含细胞生物样本，其优选是血液样本或源自血液的样本如血浆或血清，与下组接触：a)至少一种高分子量聚氧乙烯聚合物，分子量至少1500，优选为2000–40000，更优选2000-30000、2500–25000或3000-20000；b)一种或多种式1所示的化合物，优选地浓度使得与含细胞生物样本的混合物中的浓度范围为0.25％-5％、0.3％-4％、0.4％-3％、0.5％-2％或0.75％-1.5％；c)至少一种半胱天冬酶抑制剂，优选泛半胱天冬酶抑制剂，更优选Q-VD-Oph，优选地浓度使得与含细胞生物样本的混合物中的半胱天冬酶抑制剂的浓度范围为0.1μM-20μM，更优选0.5μM-10μM，更优选1μM-10μM，更优选3μM-7.5μM；d)任选的至少一种其他聚氧乙烯聚合物，其分子量低于使用的所述高分子量聚氧乙烯聚合物的分子量至少100、优选至少200、至少300或至少400，其中所述其他聚氧乙烯聚合物优选是低分子量聚氧乙烯，其分子量为1000或更低，优选分子量为200-800或200-600；e)任选的螯合剂，更优选EDTA。17.如权利要求14-16中一项或多项所述的方法，其特征在于，为固定，所述包含细胞的样本，其优选为血液样本，与下组接触：a)至少一种高分子量聚氧乙烯聚合物，分子量至少3000；b)一种或多种式1所示的化合物；c)至少一种半胱天冬酶抑制剂；d)任选至少一种低分子量聚氧乙烯聚合物，分子量为1000或更低；e)任选地螯合剂，优选EDTA，其中，由于固定，减少了从包含在包含细胞的样本内的细胞释放基因组DNA进入样本的无细胞部分。18.如权利要求1-17中一项或多项所述的方法，其特征在于，所述包含细胞的样本为血液样本，其与下组接触：a)至少一种高分子...

【专利技术属性】
技术研发人员：D·哥尔兹，
申请(专利权)人：凯杰有限公司，
类型：发明
国别省市：德国;DE