DNA甲基化检测制造技术

本发明专利技术涉及一种检测靶寡核苷酸分子的甲基化的方法。所述方法包含获得由于带电甲基化检测分子与所述靶寡核苷酸分子的结合而出现的电性变化；其中所述带电甲基化检测分子具有与甲基化胞嘧啶核苷酸的亲和力。本发明专利技术改进所述寡核苷酸甲基化检测的检测灵敏度和精确性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种分子检测技术。更确切地说，本专利技术涉及DNA甲基化检测。
技术介绍
分子检测在临床诊断和分子生物学研究方面起重要作用。举例来说，DNA甲基化检测被视为若干应用中的关键检测。DNA中的胞嘧啶(也称为甲基化胞嘧啶或5-甲基胞嘧啶)的5'碳的甲基化为调节基因表达且在胚胎发育中起关键作用的表观遗传修饰，且被认为涉及癌症、基因组印迹、细胞分化和阿尔茨海默氏病(Alzheimer'sdisease)(栗田(Kurita),亮司(Ryoji)和丹羽治(OsamuNiwa).“通过凸出部分特异性免疫识别触发的DNA甲基化分析(DNAmethylationanalysistriggeredbybulgespecificimmuno-recognition)”.分析化学(Analyticalchemistry)84.17(2012):7533-7538)。已开发若干系统以进行用于检测和/或鉴别DNA分子中的5-甲基胞嘧啶的数目和/或位置的DNA甲基化检测。DNA甲基化检测的主要方法为亚硫酸氢盐转化法(李斯特(Lister),瑞恩(Ryan)等人“碱基分解下的人类DNA甲基化组显示分布广泛的表观基因组差异(HumanDNAmethylomesatbaseresolutionshowwidespreadepigenomicdifferences)”自然(Nature)462.7271(2009):315-322)。在所述方法中，待测试的DNA分子用亚硫酸氢盐处理以将胞嘧啶核苷酸转化为尿苷核苷酸，留下未经转化的5-甲基胞嘧啶核苷酸。转化的尿苷核苷酸在聚合酶链反应的后续复制中进一步转化为胸腺嘧啶核苷酸。另一方面，未经转化的5-甲基胞嘧啶核苷酸在复制中仍为胞嘧啶核苷酸。为了区分转化的胸腺嘧啶核苷酸与未经转化的胞嘧啶核苷酸，应用基因定序或微阵列方法。举例来说，全基因组鸟枪亚硫酸氢盐定序(WGSGS)用于分析亚硫酸氢盐转化之后的全基因序列，且可通过单碱基分解获得特定情况下的甲基化模式。然而，所述定序为费力且成本高的。为了补救所述缺陷，开发与限制酶联合的简化表示亚硫酸氢盐定序(RRBS)方法以消除不必要片段，但成本仍不符合要求。另一方法为使用微阵列方法，其能够以快速和高通量方式分析特定片段的甲基化模式，且广泛应用于药物筛选。尽管如此，微阵列方法未能测定5-甲基胞嘧啶核苷酸的数目和位置。也已开发用于DNA甲基化检测生物同切点酶方法。同切点酶为对相同识别位点具有特异性的限制酶对。常用同切点酶中的一个为仅识别未甲基化胞嘧啶核苷酸且并不识别甲基化胞嘧啶核苷酸的甲基化敏感性酶。另一常用同切点酶为仅识别甲基化胞嘧啶核苷酸且并不识别未甲基化胞嘧啶核苷酸的甲基化依赖性酶。通过并入不同种类的同切点酶，可检测5-甲基胞嘧啶核苷酸。不幸的是，所述方法的应用由于同切点酶的固有特性而高度受限，且仅可检测位于特定同切点酶对的识别位点的5-甲基胞嘧啶核苷酸。DNA甲基化检测的另一方法为亲和力方法。与5-甲基胞嘧啶核苷酸具有特异性亲和力的抗体或蛋白质用于捕获含有5-甲基胞嘧啶核苷酸的片段，且基因定序或微阵列方法随后用于分析捕获片段。亲和力方法的实例为使用抗体的甲基化DNA免疫沉淀(MeDIP)(韦伯(Weber),迈克尔(Michael)等人“与染色体同宽且启动子特异性分析鉴别正常和转化人类细胞中的差异性DNA甲基化的位点(Chromosome-wideandpromoter-specificanalysesidentifysitesofdifferentialDNAmethylationinnormalandtransformedhumancells.)”自然·遗传学(Naturegenetics)37.8(2005):853-862)或使用甲基结合域蛋白质(MBD)的甲基化CGI恢复分析(MIRA)(克洛斯(Cross),萨利H(SallyH.)等人“使用甲基化DNA结合柱的CpG岛的纯化(PurificationofCpGislandsusingamethylatedDNAbindingcolumn)”自然·遗传学6.3(1994):236-244；栗田,亮司和丹羽治.“通过凸出部分特异性免疫识别触发的DNA甲基化分析”分析化学84.17(2012):7533-7538)。在亲和力方法中，通过如声处理的方式提供片段且必要时还提供单链片段。抗体或蛋白质首先用于捕获含有5-甲基胞嘧啶核苷酸的片段。在与抗体或蛋白质分离之后，捕获片段通过基因定序或微阵列分析。由于需要定序或微阵列方法，由如上所述的方法产生的缺陷无法避免。
技术实现思路
为了改进DNA甲基化检测灵敏度和精确性，提供一种快速且方便的检测方法。本专利技术提供一种检测靶寡核苷酸分子的甲基化的方法，其包含获得由于带电甲基化检测分子与靶寡核苷酸分子的结合而出现的电性变化；其中带电甲基化检测分子具有与甲基化胞嘧啶核苷酸的亲和力。本专利技术还提供一种检测靶寡核苷酸分子的甲基化的试剂盒，其包含：具有与甲基化胞嘧啶核苷酸的亲和力的带电甲基化检测分子；和用于检测电性变化的电性变化检测元件。在以下部分中详细描述本专利技术。本专利技术的其它特征、目的和优点可发现于具体实施方式和权利要求书中。附图说明图1显示检测本专利技术的一个实施例中的靶寡核苷酸分子的甲基化的方法的示意图。图2显示根据本专利技术的电中性核苷酸的一个优选实施例。图3显示具有SEPT9甲基DNA标靶1(C5)的SEPT9DNA探针1的Id-Vg曲线。“■”指示10mM双-三丙烷缓冲液中检测的电信号；“●”指示通过SEPT9甲基DNA标靶1诱导的电信号；“▲”指示通过1μg/mL抗甲基胞嘧啶抗体诱导的电信号。图4显示具有SEPT9甲基DNA标靶2(C14)的SEPT9DNA探针1的Id-Vg曲线。“■”指示10mM双-三丙烷缓冲液中检测的电信号；“●”指示通过SEPT9甲基DNA标靶2诱导的电信号；“▲”指示通过1μg/mL抗甲基胞嘧啶抗体诱导的电信号。图5显示具有SEPT9甲基DNA标靶3(C26)的SEPT9DNA探针1的Id-Vg曲线。“■”指示10mM双-三丙烷缓冲液中检测的电信号；“●”指示通过SEPT9甲基DNA标靶3诱导的电信号；“▲”指示通过1μg/mL抗甲基胞嘧啶抗体诱导的电信号。图6显示通过靶DNA(左侧柱)和抗体(右侧柱)诱导的纳米线FET(NWFET)的阈值电压位移。图7显示抗体与靶DNA的阈值电压位移比率。图8显示具有SEPT9甲基DNA标靶6(C2,16,32)的SEPT9DNA探针2的Id-Vg曲线。“■”指示10mM双-三丙烷缓冲液中检测的电信号；“●”指示通过SEPT9甲基DNA标靶6诱导的电信号；“▲”指示通过0.25μg/mL抗甲基胞嘧啶抗体诱导的电信号。图9显示通过靶DNA(左侧柱)和抗体(右侧柱)诱导的NWFET的阈值电压位移。1×意指靶寡核苷酸分子具有一个甲基化胞嘧啶核苷酸。2×意指靶寡核苷酸分子具有两个甲基化胞嘧啶核苷酸。3×意指靶寡核苷酸分子具有三个甲基化胞嘧啶核苷酸。图10显示抗体与靶寡核苷酸分子的阈值电压位移比率。图11显示具有SEPT9甲基DNA标靶7的SEPT9DNA探针2的Id-Vg曲线。图12显示本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测靶寡核苷酸分子的甲基化的方法，其包含获得由于带电甲基化检测分子与所述靶寡核苷酸分子的结合而出现的电性变化；其中所述带电甲基化检测分子具有与甲基化胞嘧啶核苷酸的亲和力。

【技术特征摘要】
2015.07.15 US 62/192,9871.一种检测靶寡核苷酸分子的甲基化的方法，其包含获得由于带电甲基化检测分子与所述靶寡核苷酸分子的结合而出现的电性变化；其中所述带电甲基化检测分子具有与甲基化胞嘧啶核苷酸的亲和力。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述带电甲基化检测分子选自由以下组成的群组：抗甲基胞嘧啶抗体、甲基结合域蛋白质和限制酶。3.根据权利要求1所述的方法，其中所述电性变化为阈值电压位移变化。4.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶寡核苷酸分子具有具有至少一个甲基化胞嘧啶核苷酸的靶序列，且所述方法包含：通过识别单链寡核苷酸分子捕获所述靶寡核苷酸分子的单链以根据碱基互补性形成双螺旋；提供所述带电甲基化检测分子；和将所述双螺旋与所述带电甲基化检测分子结合且检测由所述结合所致的电性变化。5.根据权利要求4所述的方法，其中由所述靶寡核苷酸分子的单链和所述识别单链寡核苷酸分子形成的所述双螺旋包含凸出部分且所述甲基化胞嘧啶核苷酸安置于所述凸出部分中。6.根据权利要求4所述的方法，其中所述识别单链寡核苷酸分子附接到固体表面或所述识别单链寡核苷酸分子与所述固体表面间隔开一定距离。7.根据权利要求6所述的方法，其中所述固体表面为场效应晶体管FET的晶体管表面或表面等离子体共振SPR的金属表面。8.根据权利要求6所述的方法，其中所述固体表面的材料为多晶硅或单晶硅。9.根据权利要求6所述的方法，其中所述固体表面与检测所述电性变化的电性变化检测元件耦接。10.根据权利要求9所述的方法，其中所述电性变化检测元件为场效应晶体管或表面等离子体共振。11.根据权利要求4所述的方法，其中所述识别单链寡核苷酸分子为包含至少一个电中性核苷酸和至少一个带负电核苷酸的部分中性单链寡核苷酸。12.根据权利要求11所述的方法，其中所述电中性核苷酸包含经C1-C6烷基取代的磷酸酯基。13.根据权利要求11所述的方法，其中所述带负电核苷酸包含未经取代的磷酸酯基。14.根据权利要求11所述的方法，其中所述识别单链寡核苷酸分子附接到固体表面，且所述部分中性单链寡核苷酸包含附接到所述固体表面的第一部分；所述第一部分的长度为所述部分中性单链寡核苷酸的总长度的约50％；且所述第一部分包含至少一个电中性核苷酸和至少一个带负电核苷酸。15.根据权利要求1所述的方法，其包含以下步骤：(a)提供所述靶寡核苷酸分子的单链；所述识别单链寡核苷酸分子；具有无甲基化胞嘧啶...

【专利技术属性】
技术研发人员：詹维康，杨裕雄，陈文逸，傅昶惟，
申请(专利权)人：慧源生技有限公司，
类型：发明
国别省市：中国台湾;71