本发明专利技术公开了一种硼酸衍生物功能化荧光探针在检测5‑羟甲基胞嘧啶中的应用，其中所述的硼酸衍生物功能化荧光探针是表面固载2‑(4‑二羟基硼烷)苯基‑4‑羧基喹啉的聚甲基丙烯酸环氧丙酯纳米微球。本发明专利技术荧光探针不仅具有2‑(4‑二羟基硼烷)苯基‑4‑羧基喹啉的荧光特性，而且保留了聚甲基丙烯酸环氧丙酯纳米微球的良好生物兼容性，能够特异性吸附糖基化后的5‑羟甲基胞嘧啶，实现对5‑糖基化胞嘧啶的简单、快速、高灵敏度、低检出限检测。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于DNA中5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)的检测
，具体涉及一种可特异性识别顺式二羟基结构的2-(4-二羟基硼烷)苯基-4-羧基喹啉(PBAQA)功能化荧光复合物传感材料(PBAQA-PGMA)在检测DNA链中5hmC的应用。
技术介绍
5-甲基胞嘧啶(5mC)在调控基因表达、基因组印记和X染色体失活中起着至关重要的作用。近来发现，5mC在TET(teneleventranslocation)家族双加氧酶Fe2+/α-酮戊二酸的催化作用下可以被氧化为5hmC。5hmC作为一种1952年被发现至2009年才被再次发现进而得到广泛研究的新型胞嘧啶变异体，目前已经被公认为是继5mC之后的第六种碱基。该碱基在生物生理学过程中有着至关重要的作用。研究证明，5hmC是DNA去甲基化过程的重要中间产物，它可能是一种可以独立存在较稳定的表观遗传修饰。研究还发现，在一些癌症诸如肺癌、脑癌、肝癌、肾癌、皮肤癌、前列腺癌中5hmC的含量明显下降，证明其在癌症发展过程中扮演者重要的角色。除此之外，5hmC在亨廷顿舞蹈症、骨髓增生异常综合症、阿尔兹海默症这些疾病中的分布也表现出异常。这些发现均预示5hmC将可能成为一种疾病诊断、处理和治疗的新兴生物学标志。目前很多特定的技术已经被用于检测组织中的5hmC，包括薄层色谱法、高效液相色谱串联二级质谱法、同位素标记法、抗原抗体酶联免疫技术等，但这些方法存在一些无法克服的缺点，比如需要用到放射性元素，无论是对人体还是环境都有害，检测仪器昂贵，操作繁琐等。基于此逐渐出现了光谱法检测5hmC，如：将5hmC中的羟甲基氧化为醛基，通过醛基将一些荧光基团标记到DNA链上进行荧光检测；氧化后通过荧光共振能量转移法进行荧光检测；通过糖基化反应将含有叠氮基团的糖基转移到5hmCDNA链上，通过生物素标记、链霉亲和素标记法进行荧光标记等。但这些荧光方法需要至少两步提纯过程，从而增大了DNA的损失率，而且操作过程繁琐，有些难以避免背景因素干扰。公开号为CN104483295A的专利技术专利申请公开了一种基于硼酸衍生物功能化荧光探针检测糖蛋白等二醇类物质的方法，该方法操作简单，检测灵敏度高。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于为硼酸衍生物功能化荧光探针提供一种新的应用。解决上述技术问题所采用的技术方案是：硼酸衍生物功能化荧光探针在检测5-羟甲基胞嘧啶中的应用，所述硼酸衍生物功能化荧光探针是表面固载2-(4-二羟基硼烷)苯基-4-羧基喹啉的聚甲基丙烯酸环氧丙酯纳米微球，其中聚甲基丙烯酸环氧丙酯纳米微球的粒径为150～400nm。上述硼酸衍生物功能化荧光探针的制备方法为：将聚甲基丙烯酸环氧丙酯纳米微球(PGMA)溶解于蒸馏水中，并加入过量乙二胺，在氮气保护下，80℃反应完全后，离心、洗涤、干燥，得到氨基功能化的PGMA；将氨基功能化的PGMA分散于无水乙醇中，并依次加入2-(4-二羟基硼烷)苯基-4-羧基喹啉(PBAQA)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，其中氨基功能化的PGMA与PBAQA、EDC、NHS的摩尔量比为4:4:9:9，超声分散均匀，40℃反应完全后，离心分离，产物依次用超纯水、无水乙醇和乙腈洗涤，自然干燥，得到表面固载2-(4-二羟基硼烷)苯基-4-羧基喹啉的聚甲基丙烯酸环氧丙酯纳米微球(PBAQA-PGMA)，即硼酸衍生物功能化荧光探针。上述的硼酸衍生物功能化荧光探针在检测5-羟甲基胞嘧啶中的应用，具体检测方法由下述步骤组成：1、将5-羟甲基化胞嘧啶DNA标准样品与尿苷二磷酸葡萄糖在T4β-葡萄糖基转移酶的催化作用下，25～37℃反应1～2小时，分离提纯产物，得到5-糖基化胞嘧啶DNA。2、将硼酸衍生物功能化荧光探针与5-糖基化胞嘧啶DNA加入pH＝7.4的磷酸缓冲液中，室温震荡反应，用荧光光谱仪测量不同浓度5-糖基化胞嘧啶DNA对应体系的荧光强度，绘制F-F0值随5-糖基化胞嘧啶DNA浓度变化的标准曲线。3、按照步骤2的方法用荧光光谱仪测量待测DNA样品的荧光强度，根据待测DNA样品的F-F0值，结合标准曲线的线性方程即可高选择性识别5-羟甲基胞嘧啶DNA并确定待测DNA样品中5-羟甲基胞嘧啶的含量。上述步骤2中，优选磷酸缓冲液中硼酸衍生物功能化荧光探针的初始浓度为0.2～1mg/mL。本专利技术将PBAQA通过EDC/NHS接枝到氨基功能化的PGMA表面，从而得到兼具荧光性质和特异性识别二醇物质的硼酸衍生物功能化荧光探针，该荧光探针能够特异性吸附糖基化后的5-羟甲基胞嘧啶，既解决了DNA序列中胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-羟甲基胞嘧啶由于结构相似难以区分检测的问题，又为光谱法检测5-羟甲基胞嘧啶提供了新方法，且该方法简单、快速、灵敏度高，克服了已有方法测量仪器复杂、昂贵、操作繁琐等弊端，同时与其他一些检测方法相比还可以实现对5-糖基化胞嘧啶的富集，降低检出限，使5-糖基化胞嘧啶的检出限降低至0.16nmol/L。附图说明图1是正常DNA的MALDI-TOFMS图。图2是5-羟甲基胞嘧啶DNA的MALDI-TOFMS图。图3是糖基化处理的正常DNA的MALDI-TOFMS图。图4是5-糖基化胞嘧啶DNA的MALDI-TOFMS图。图5是荧光强度随5-糖基化胞嘧啶DNA浓度变化的荧光光谱图。图6是F-F0值随5-糖基化胞嘧啶DNA浓度变化的标准曲线。图7是PBAQA-PGMA对糖基化的5-羟甲基胞嘧啶DNA的特异性识别荧光图。图8是PBAQA-PGMA对糖基化的5-甲基胞嘧啶DNA的荧光检测图。图9是PBAQA-PGMA对糖基化的正常DNA的荧光检测图。具体实施方式下面结合附图和实施例对本专利技术进一步详细说明，但本专利技术的保护范围不仅限于这些实施例。下面实施例中所用的硼酸衍生物功能化荧光探针由下述方法制备得到：将粒径为200nm的PGMA溶解于30mL蒸馏水中，并加入30mL乙二胺，在氮气保护下，80℃反应12小时，反应完后，离心分离，所得产物用蒸馏水洗涤3次后，60℃干燥，得到氨基功能化的PGMA。将0.058g氨基功能化的PGMA(0.4mmol)分散于40mL无水乙醇中，并依次加入0.12gPBAQA(0.4mmol)、0.115gEDC(0.9mmol)、0.069g(0.9mmol)NHS，超声分散均匀，40℃反应7小时，反应完后，离心分离，所得产物依次用超纯水、无水乙醇和乙腈洗涤，自然干燥，得到PBAQA-PGMA，即硼酸衍生物功能化荧光探针。实施例1硼酸衍生物功能化荧光探针在检测5-羟甲基胞嘧啶中的应用，具体检测方法由下述步骤组成：1、将5-羟甲基胞嘧啶DNA(碱基序列5'-CTTAAGCCG(5hmC)AGGTACCTTCC-3'，分子量为6372.2)标准样品溶于超纯水中，配制成100μmol/L5-羟甲基胞嘧啶DNA水溶液。将1μL10000U/mLT4-β-葡萄糖基转移酶溶液加入32μL1.25×NEBuffer4中，并加入1μL2mmol/L尿苷二磷酸葡萄糖、10μL100μmol/L5-羟甲基胞嘧啶DNA水溶液，混合均匀后，37℃反应1小时，反应结束后，恢复到常温，向反应溶液中加入等本文档来自技高网...
【技术保护点】
硼酸衍生物功能化荧光探针在检测5‑羟甲基胞嘧啶中的应用，其中所述的硼酸衍生物功能化荧光探针是表面固载2‑(4‑二羟基硼烷)苯基‑4‑羧基喹啉的聚甲基丙烯酸环氧丙酯纳米微球。
【技术特征摘要】
1.硼酸衍生物功能化荧光探针在检测5-羟甲基胞嘧啶中的应用，其中所述的硼酸衍生物功能化荧光探针是表面固载2-(4-二羟基硼烷)苯基-4-羧基喹啉的聚甲基丙烯酸环氧丙酯纳米微球。2.根据权利要求1所述的硼酸衍生物功能化荧光探针在检测5-羟甲基胞嘧啶中的应用，其特征在于：聚甲基丙烯酸环氧丙酯纳米微球的粒径为150～400nm。3.根据权利要求1或2所述的硼酸衍生物功能化荧光探针在检测5-羟甲基胞嘧啶中的应用，其特征在于具体检测方法由下述步骤组成：(1)将5-羟甲基胞嘧啶DNA标准样品与尿苷二磷酸葡萄糖在T4β-葡萄糖基转移酶的催化作用下，25～37℃反应1～2小时，分离提纯产物，得到5-糖基化胞嘧啶DNA；(...
【专利技术属性】
技术研发人员：张静，陈华艳，潘炯秀，张微，魏静茹，
申请(专利权)人：陕西师范大学，
类型：发明
国别省市：陕西;61
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