选择性分离核酸的方法及其套组技术

本发明专利技术揭露一种选择性分离核酸的方法与套组，其透过不同种类及浓度的离液盐、单价离子盐和拥挤试剂的相互搭配，使得固相载体能够与不同大小的核酸片段结合，利用当单价离子盐浓度愈高则保留愈大的核酸片段及当单价离子盐浓度愈低则保留愈小的核酸片段，来达到特定片段大小的核酸的筛选的效果。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术关于一种核酸分离的技术，特别是指一种选择性分离核酸的方法及其套组。
技术介绍
随着人类以及其他物种的基因体逐渐被解碼，以核酸(包括DNA和RNA)作为检测标的的分子诊断技术成为近年来临床检测上的一大重点。无论是DNA或者是RNA，都是由四个核苷酸分子所组成，因此相较于复杂的临床病理判读，核酸的分子组成相对简单，也较为容易进行检测。以核酸为标的进行分子诊断的过程中，核酸片段大小的筛选扮演了相当重要的角色。例如血液系统当中的游离核酸(cell-freenucleicacids)，常被运用作为胎儿产前检测与癌症检测的主要核酸来源。但是，游离核酸多为短序列的片段，并且在样本当中的含量相对于其他大片段核酸较为微量。因此，如何取得足够含量的短片段核酸，并且去除其他大片段核酸，是决定检测结果是否准确的重要因素。另一方面，次世代定序(nextgenerationsequencing；NGS)技术由于其无需利用细菌进行质体的复制、高通量以及时间短等优点，近年来被广泛的使用在各种以核酸为标的的分子诊断技术当中，作为核酸定序的主要工具。以Illumina系统的NGS为例，其进行主要是先将待测核酸片段化之后，对这些不同大小片段的核酸进行筛选，再依照需求将特定的短序列片段进行纯化、回收浓缩或以聚合酶连锁反应(polymerasechainreaction；PCR)来增幅并建构核酸库。再将核酸库的核酸片段与接合序列连接，将连接后的片段注入到表面带有接合片段互补序列的芯片上进行桥式PCR以及荧光的标记与侦测。核酸片段的筛选可以应用在核酸库建构的前处理、去除为未接妥接合序列的核酸片段以及PCR增幅之后除去非目标核酸片段等步骤，以提升定序过程中核酸的质量与含量。针对前述核酸片段的筛选，实质上回收的目标核酸序列通常不长，且在本领域中常惯称做「小片段核酸」(smallfragments)，因此，如何提升小片段核酸回收效果，以维护、强化定序质量，目前已发展出数种方法因应，其中常见的主要包括三种：(1)以洋菜胶(agarosegel)电泳区分出不同序列尺寸之核酸，再以切胶回收的方式，针对目标片段(通常是小片段核酸)进行分离回收，这种方式可精确回收特定片段的核酸，却存有耗时费力的缺点。此外，因为小片段核酸受限于分子量较小，在洋菜胶上的显像分辨率较差，尤其是在浓度低的时候，更容易妨碍切胶回收的效果；(2)利用披覆(coated)DNA分子与表面官能基改质(例如带有羧基)的磁珠(magneticbeads)，配合聚乙二醇(polyethyleneglycol；PEG)和盐类的浓度条件，吸附并结合待分离的小片段核酸，如同美国公告专利第6534262号所揭露。这种方法的优点在于可轻易套用至自动化系统，进行大量的分离、筛选，但除了须选用特殊改质的磁珠造成的额外成本与工序之外，这种方法经证实显然不适用于序列尺寸较长(例如序列长度大于约400bp以上)的核酸，明显限制了此方法在NGS技术上的应用；(3)可利用设计引子(primer)或诱引序列(bait)精确回收核酸，惟此法仅适用于已知待定序的目标序列的状况下，难以广泛应用。根据上述常用方法未能解决的问题，目前仍持续有技术改良，但仍各有其限制，举例说明如下：美国专利技术专利公告第US6534262B1号提出一种方法，藉由调整PEG条件配合带有官能基的固态载体，来调整反应溶液中的离子强度(ionicstrength)及PEG的浓度，改善回收小片段核酸效果。此外，以美国专利技术公开专利第US20060024701号及美国公开专利第US20110060135号为例，可见其均采用调整PEG方法达成分离、回收小片段核酸，均须搭配官能基(羧基或胺基)改质的固态载体(膜状、微粒、磁珠)，势必增加制造的成本与复杂度。世界专利第WO2013181651A1号提出了一种回收小片段核酸的方法，藉由调整胍盐浓度及pH值调整小片段核酸黏附至(solidcarrier)的效果，藉以改善回收效果，但根据NGS序列尺寸筛选的应用时机多元，回收核酸时，势必面临多元化且复杂的溶液环境，很可能引发pH值的变化，降低此方法之效果与可靠性；此外，在生产相关溶液试剂时，对于pH值的精准度的要求标准相对提高，甚至需要增加检验工序，额外耗时且增加制造成本。美国公开专利第US20140243216号亦使用调节pH值的策略达成回收小片段核酸的目的，因此，根据其对pH的依赖程度，可预期该方法同样存有不同的环境溶液对其效果可能产生的不利影响。
技术实现思路
为解决上述先前技术之缺失，本专利技术的主要目的是利用一种选择性分离核酸的方法来分离特定序列长度的核酸。本专利技术的另一目的在于提供一种简单的反应缓冲液，让操作者可依照预定之核酸序列长度需求，轻易地从含有序列长度不一之核酸混合液中，分离出特定序列长度之核酸。本专利技术的再一目的可以让使用者选择性分离出特定序列长度之核酸并直接应用至后续工序，不仅快速方便、节省成本，回收率(recovery)亦佳，亦能提高后续应用之效能。本专利技术进一步的目的在于提供的核酸分离方法所使用的溶液环境简单且稳定，可排除pH值变化对纯化、分离核酸效果的影响，亦无须倚赖特定聚合物溶质或界面活性剂，例如聚乙二醇(PEG)溶液系统，更无须使用官能基(例如表面羧基化、胺基化)改质之载体，十分适合应用于现有之自动化系统进行高通量之操作，同时满足了分离核酸之精准度、分离与纯化效能、便利性等需求。本专利技术的更一目的是利用成分单纯的盐类溶液和拥挤试剂配合硅基(silica-based)滤材使用，即可达成分离特定序列长度的核酸。本专利技术的又一目的在于提出一种配方简易、不需使用聚合物溶剂、不需采用官能基改质之滤材亦无需倚赖pH值的简单方法，尤其适用于分离特定范围的核酸片段。为达成前述目的，本专利技术揭露一种选择性分离核酸的方法，其步骤如下：混合样本核酸与结合缓冲液以产生混合溶液，其中样本核酸具有特定大小的核酸片段，混合溶液具有离液盐，以及单价离子盐或拥挤试剂至少其中之一；使混合溶液流过固相载体，藉由单价离子盐浓度的高低来控制欲保留的特定大小的核酸片段结合于固相载体，其中当单价离子盐浓度愈高则保留愈大的核酸片段及当单价离子盐浓度愈低则保留大范围的核酸片段,其中大范围的核酸片段包含大尺寸的核酸片段及小尺寸的核酸片段；使冲洗缓冲液流过固相载体以清除未与固相载体结合的物质；以及使水溶液流过固相载体以回收欲保留的特定片段大小的核酸片段。本专利技术另揭露一种选择性分离核酸的方法，其步骤如下：混合样本核酸与第一结合缓冲液以产生第一混合溶液，其中样本核酸具有特定大小的核酸片段，第一混合溶液具有离液盐，使第一混合溶液流过第一固相载体，以取得一次筛选液，其中，一次筛选液含有特定大小的核酸片段；混合一次筛选液与第二结合缓冲液以产生第二混合溶液，其中，第二混合溶液具有离液盐以及单价离子盐或拥挤试剂至少其中之一；使第二混合溶液流过第二固相载体，藉由所述单价离子盐浓度的高低来控制将欲保留的特定大小的核酸片段结合于第二固相载体，其中当单价离子盐浓度愈高则保留愈大的核酸片段及当单价离子盐浓度愈低则保留大范围的核酸片段,其中大范围的核酸片段包含大尺寸的核酸片段及小尺寸的核酸片段；使冲洗缓冲液流过第二固相载体以本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种选择性分离核酸的方法，其包含有下列步骤：(a)混合样本核酸与结合缓冲液以产生混合溶液，其中所述样本核酸具有特定大小的核酸片段，所述混合溶液具有离液盐，以及单价离子盐或拥挤试剂至少其中之一；(b)使所述混合溶液流过固相载体，藉由所述单价离子盐浓度的高低来控制将欲保留的特定大小的核酸片段结合于所述固相载体，其中当所述单价离子盐浓度愈高则保留愈大的核酸片段及当所述单价离子盐浓度愈低则保留大范围的核酸片段,其中所述大范围的核酸片段包含大尺寸的核酸片段及小尺寸的核酸片段；(c)使冲洗缓冲液流过所述固相载体以清除未与所述固相载体结合的物质；以及(d)使水溶液流过所述固相载体以回收所述欲保留的特定片段大小的核酸片段。

【技术特征摘要】
2015.09.02 TW 1041291331.一种选择性分离核酸的方法，其包含有下列步骤：(a)混合样本核酸与结合缓冲液以产生混合溶液，其中所述样本核酸具有特定大小的核酸片段，所述混合溶液具有离液盐，以及单价离子盐或拥挤试剂至少其中之一；(b)使所述混合溶液流过固相载体，藉由所述单价离子盐浓度的高低来控制将欲保留的特定大小的核酸片段结合于所述固相载体，其中当所述单价离子盐浓度愈高则保留愈大的核酸片段及当所述单价离子盐浓度愈低则保留大范围的核酸片段,其中所述大范围的核酸片段包含大尺寸的核酸片段及小尺寸的核酸片段；(c)使冲洗缓冲液流过所述固相载体以清除未与所述固相载体结合的物质；以及(d)使水溶液流过所述固相载体以回收所述欲保留的特定片段大小的核酸片段。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(a)中的所述离液盐为盐酸胍、异硫氰酸胍、碘化钠或过氯酸钠。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(a)中的所述单价离子盐为氯化锂、醋酸锂、醋酸钠、醋酸钾或醋酸铵。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(a)中的所述拥挤试剂为乙醇、异丙醇或聚乙二醇。5.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述固相载体为硅质滤柱或硅质磁珠。6.一种选择性分离核酸的方法，其包含有下列步骤：(a)混合样本核酸与第一结合缓冲液以产生第一混合溶液，其中所述样本核酸具有特定大小的核酸片段，所述第一结合缓冲液具有离液盐；(b)...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗元廷，
申请(专利权)人：创想生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：中国台湾;71