核酸的分离制造技术

技术编号:11214605 阅读:129 留言:0更新日期:2015-03-27 01:33
本文提供了与分离核酸相关的技术。具体地,所述技术涉及从成问题的样品例如粪便提取核酸的方法和试剂盒。

【技术实现步骤摘要】
核酸的分离 本申请是基于申请日为2012年5月11日, 优先权日:为2011年5月12日,申请号 为201280034773. 0 (PCT/US2012/037581),专利技术名称为:核酸的分离的专利申请的分案 申请。 本专利技术要求美国临时专利申请序列号61/485, 214、61/485, 338、61/485, 386、和 61/485, 448的权益,其每一项均于2011年5月12日提交,并且其每一项通过引用整体并入 本文。 领域 本文提供了与分离核酸相关的技术。具体地,本技术涉及从成问题的样品例如粪 便提取核酸的方法和试剂盒。 专利技术背景 从样品分离特定的靶核酸是许多医学诊断测定中的重要步骤。例如,已知基因中 的某些突变和甲基化状态是与疾病相关、伴随或预兆性的。可从样品中回收包含这些基因 的DNA并且测试具体突变和甲基化状态的存在。 实际上,这些测定需要从样品分离并测定若干基因靶。对于许多检测方法来说,检 测单个基因中的罕有突变或甲基化状态需要分离并且测试大量的DNA。这一问题在测定一 组基因时被加剧,所述基因中的每一个必须大量存在以用于稳健的诊断测试。因此,为了检 测多个基因中的罕见突变和甲基化事件,所分离的DNA必须被高度浓缩并且组成检测测定 的很大部分。 然而,这一需求带来了许多问题。例如,制备这样的量和浓度的DNA需要大的样品 作为投入物(例如具有几克例如大约2-4克的质量)以提供足够核酸用于检测并且因此需 要可从大的样品制备DNA的方法。此外,测定抑制剂常常随着DNA制品一起被分离和浓缩。 因此,通过常规方法生产的浓缩的DNA制品同样常常保留不可接受的浓度的抑制剂,其之 后被引入随后的测定中。而且,如果在大批的非选择性的DNA制品中同时提取组中的所有 靶,那么测定的敏感度受损,因为当制品被分为等份用于测试时测定中存在是较少的从组 中任一种基因提取的DNA。如果另一方面,组中的所有成员被一起提取和测试并且由此存在 于同一测定混合物中,那么检测任一种单个的特定靶的敏感度因非靶DNA分子的存在而受 损。 此外,如果复杂的样品中存在特定的诊断靶,那么它将以相对于样品中其他材 料一核酸和非核酸两种一相对小的量存在,因此为设计用于检测其的分析方法带来了挑 战。例如,来自粪便样品的DNA的分析因细菌构成了粪的大约60%的干重而其余的大部分 是作为食物被受试者消化的植物和动物物质的残留的事实而变得复杂。像这样,仅是从消 化道的内膜蜕化的那些的人类受试者的细胞是粪便中非常小的部分并且存在大量来自其 他材料的核酸。而且,在检测指示直肠癌的基因修饰的测定中,来源于直肠中可能存在的 肿瘤的细胞将仅占从消化道内膜蜕化的人类受试者消化道细胞的一小部分。因此,癌细胞 (和它们包含的DNA)构成极小量的粪便质量。这样的样品同样常常是非常粘性的,其在核 酸的样品制备和分离上存在问题。 从样品分离DNA的常规方法和试剂盒通常从样品制备总DNA(例如通过非特异性 的制备方法)。对于复杂的样品例如粪便样品来说,这是常规方法特有的缺点,因为从粪便 样品分离的总DNA包含伴随来自受试者的DNA -起的来自消化道常驻细菌(以及存在的任 何病毒、真核生物以及古生菌)的DNA。而且,常规方法和试剂盒主要设计用于从小样品例 如具有少于1克诸如50至200毫克的质量的样品制备DNA,将来自复杂样品的靶核酸的产 量限制在非常小的量。另外的缺点是大多数常规技术并不有效地去除抑制剂并且常常需要 长的加工步骤,例如孵育。因此,常规方法不适于高敏感度和高特异性的多个基因组分析, 因为它们不能从大的样品例如几克的粪便样品制备足够量的高度浓缩的无抑制剂的DNA。 使用用常规方法制备的DNA的测定将不能提供可以检测罕有的突变或甲基化事件所需要 的敏感度阈值测定的样品。使用常规方法或试剂盒获取获得这样的敏感度所需的起始质量 需要除了额外的纯化步骤之外的多重DNA提取(例如使用多重试剂盒)以去除抑制剂。因 此,所需要的是从样品制备一组基因的每个成员的浓缩的无抑制剂的DNA以便在诊断测定 中使用。 概述 本文提供的是与分离核酸有关的技术。具体地,所述技术涉及用于从粪便样本中 脱落的肠道细胞提取并且纯化核酸以便用于定量和敏感的测定。所述技术具体为使用抑制 剂去除步骤从粪便纯化特定DNA以及从粪便上清液直接捕获DNA或这些步骤的组合的新方 法。所述技术进一步提供了适于与复杂并且粘性的样品例如粪便样品一起使用的过滤设 备。因此,本文提供的是从样品分离靶核酸的方法,所述方法包括从样品去除测定抑制剂, 如果存在的话,以产生澄清的样品;用捕获试剂从澄清的样品捕获靶核酸,如果存在的话, 以形成捕获复合物;从澄清的样品分离捕获复合物;并且从核酸溶液中的捕获复合物回收 靶核酸,如果存在的话。在一些实施方案中,所述方法进一步包括在捕获步骤之后保留澄清 的样品;和使用所保留的澄清的样品和第二捕获试剂重复分离和回收步骤。 在一些实施方案中,除去抑制剂包括将样品匀浆化以产生匀浆;将匀浆离心以产 生上清液;用抑制剂吸收组合物处理上清液以结合抑制剂复合物中的抑制剂,如果存在的 话;以及从上清液分离抑制剂复合物以产生澄清的样品。一些实施方案中的抑制剂吸收组 合物是聚乙烯吡咯烷酮,在一些实施方案中,聚乙烯吡咯烷酮是不溶的而在一些实施方案 中,聚乙烯批咯烧酮是聚乙烯聚批咯烧酮(polyvinylpolypyrrolidone)。通过以预量过的 形式提供聚乙烯吡咯烷酮在一些实施方案中是有用的,例如在一些实施方案中聚乙烯吡咯 烷酮作为片剂提供。各种技术被用于从样品分离抑制剂复合物。例如,在一些实施方案中, 分离抑制剂复合物包括离心以从上清液分离抑制剂复合物。 在一些实施方案中,离心包括通过旋转离心柱离心。因此,在一些实施方案中,本 文提供了涉及过滤以及特别但不排他地涉及过滤器和通过离心的方式过滤的方法。特别 地,本文提供的技术的一些实施方案通过提供其中旋转过滤器的底部末端和主体都从多孔 的或可透过的材料制得的技术解决了旋转过滤器堵塞的问题。也就是说,旋转过滤器的壁 是由与用于常规设计中底部末端的过滤设备的相同或相似的材料制成。如此,当过滤器的 底部部分在过滤过程中开始堵塞时,壁提供了可从其过滤样品的另外的表面。 本文中这一技术被提供为包含中空主体、底部末端和与底部末端相对的开放的顶 部末端的旋转过滤器,其中所述中空主体由多孔的过滤材料制得。在一些实施方案中,所述 底部末端从多孔的过滤材料制得。旋转过滤器的中空主体和底部末端呈现适于使用过滤器 的过滤应用的任何形状。例如,在一些实施方案中,中空主体是管状,而在一些实施方案中, 底部末端是半球形。在其他实施方案中,底部末端是盘形、锥形、或椭圆体的一部分。而且, 旋转过滤器从适于过滤样品的任意材料制得。因此,在一些实施方案中,多孔过滤材料是聚 乙烯。样品包含不同尺寸的颗粒、物质、沉淀物等,其将通过过滤被除去。因此,可选择过滤 材料以具有提供所期望的分离的物理特性。例如,在一些实施方案中,多孔过滤材料具有20 微米的标称孔径。在一些实施方案中,过滤器的使用产生了使用者为另外的加工保留的滤 液。如此,一些实施方案提供包含如所描述的旋转过滤器的旋本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种从包含核酸的粗制样品制品除去测定抑制剂的方法,所述方法包括:a)在分离所述核酸之前将不溶的聚乙烯吡咯烷酮在所述测定抑制剂与所述聚乙烯吡咯烷酮结合产生复合物的条件下加至所述粗制的样品制品;b)将所述复合物从所述粗制样品制品分离以产生含有所述核酸的澄清的样品制品。

【技术特征摘要】
2011.05.12 US 61/485,386;2011.05.12 US 61/485,338;1. 一种从包含核酸的粗制样品制品除去测定抑制剂的方法,所述方法包括: a) 在分离所述核酸之前将不溶的聚乙烯吡咯烷酮在所述测定抑制剂与所述聚乙烯吡 咯烷酮结合产生复合物的条件下加至所述粗制的样品制品; b) 将所述复合物从所述粗制样品制品分离以产生含有所述核酸的澄清的样品制品。2. 如权利要求1所述的方法,其中所述粗制样品制品是从粪便样品制备的上清液。3. 如权利要求2所述的方法,其中所述粪便样品具有至少4克的质量。4. 如权利要求2所述的方法,其中所述粪便样品具有至少8克的质量。5. 如权利要求1所述的方法,其中所述聚乙烯吡咯烷酮是聚乙烯聚吡咯烷酮。6. 如权利要求1所述的方法,其中所述分离包括离心。7. 如权利要求1所述的方法,其中所述澄清的样品制品是根据一种从样品产生滤液的 方法生产的,所述方法包括: a) 将有待过滤的样品放置在一种旋转过滤器中,其包括: i) 中空主体; ii) 底部末端;和 iii) 与所述底部末端相对的开放的顶部末端, 其中所述中空主体由多孔的过滤材料制得;并且 b) 离心所述旋转过滤器, 其中在所述过滤期间,所述样品的一部分经过所述旋转过滤器的多孔的过滤材料以产 生滤液。8. 如权利要求1所述的方法,其中所述聚乙烯吡咯烷酮包含具有约100微米至约130 微米的平均直径的颗粒。9. 一种用于从包含核酸的粗制样品制品除去测定抑制剂的系统,所述系统包括: a) 用于结合所述测定抑制剂并且产生复合物的不溶的聚乙烯吡咯烷酮; b) 将所述复合物从所述粗制样品制品分离以产生包含所述核酸的澄清的样品制品的 功能性;和 c) 保留包含所述核酸的澄清的样品制品的功能性。10. 如权利要求9所述的系统,其中所述聚乙烯吡咯烷酮是聚乙烯聚吡咯烷酮。11. 如权利要求9所述的系统,其中所述聚乙烯吡咯烷酮是预量形式的。12. 如权利要求9所述的系统,其中所述聚乙烯吡咯烷酮作为片剂提供。13. 如权利要求9所述的系统,其中所述分离所述复合物的功能性包括一种旋转过滤 器,其包括: a) 中空主体; b) 底部末端;和 c) 与所述底部末端相对的开放的顶部末端, 其中所述中空主体由多孔的过滤材料制得。14. 如权利要求13所述的系统,其中所述旋转过滤器的底部末端由多孔的过滤材料制 得。15. 如权利要求13所述的系统,其中所述旋转过滤器...

【专利技术属性】
技术研发人员:JJ布鲁因斯马MJ多玛尼科GP里德加德邹鸿志WG维斯伯格HD舍诺伊JP莱特二世
申请(专利权)人:精密科学公司
类型:发明
国别省市:美国;US

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