一种烟草叶组织PCR模板的制备方法技术

本发明专利技术涉及一种PCR模板的制备方法，具体涉及一种烟草叶组织PCR模板的制备方法，以NaOH溶液为提取液，将提取液与植物叶片组织放入到离心管中，直接在磨样机上磨样，得到的上清液直接作为模板进行PCR反应。本发明专利技术所具有的优点在于：(1)无需经过加热煮沸中和等步骤，上清液可直接用作PCR反应的模板；(2)制备的DNA模板PCR扩增结果稳定、准确、重复性好，与传统SDS提取法和试剂盒提取法获得的DNA相比，PCR结果没有明显差异；(3)该方法还可以应用于小麦、高粱、水稻、玉米等作物上；(4)该方法使用仪器少，样品消耗少，快速、简便、成本低，没有交叉污染，能够在短时间内处理大量样品，因此能够对大量的转基因烟草样品进行DNA的快速提取和鉴定。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种PCR模板的制备方法，具体涉及一种烟草叶组织PCR模板的制备方法，尤其是应用于转基因烟草叶片组织。
技术介绍
烟草(Nicotianatabacum)目前是国内一种重要的经济作物。培育优质、低害、抗病抗逆、适产的烟草品种是目前烟草育种的主要目标。随着分子生物学的快速发展和转基因技术的逐渐成熟，转基因技术已成为烟草育种的重要方法。近年来，随着Crispr-Cas9技术的发展，在烟草基因组中定点突变一个或多个基因甚至是整个基因家族成为可能。该技术能够对目标性状进行精确改良，通过筛选得到稳定表达转基因株系，不仅能够缩短作物的育种周期，还能够解决传统育种方法不易解决的问题，如有害性状与优良性状的紧密连锁不易打破分离。这给烟草的转基因育种带来了新的机遇。随着分子生物学的迅速发展，生物技术的研究领域逐渐拓展到生物科学的各个方面，核酸水平的研究是分子生物学研究的重要内容，PCR技术作为研究核酸的主要工具，在分子生物学领域扮演着越来越重要的角色。在植物研究领域诸如突变体的鉴定，转基因植株的鉴定，基因扩增等均需要利用到PCR技术，PCR扩增技术需要DNA作为模板。针对于烟草等作物的检验，为了降低假阳性的存在，在抗性培养基上长出的转基因苗还需进行进一步的检验。目前，多采用简便快捷，灵敏度高的PCR方法进行这一检测。而要进行PCR检测则首先需对被检测样品进行DNA提取。目前，在众多植物种类中应用最广泛的提取DNA的方法是采用商业化的试剂盒或是基于CTAB/SDS裂解后的酚即氯仿抽提法或者是由此为基础衍生而来的改良法。然而，这些方法都需要在液氮或是冷冻干燥条件下将样品粉碎，紧接而来的是很多繁琐的步骤进行DNA的纯化。这些方法不仅用到很多有害试剂和昂贵的试剂仪器，并且用到的植物组织多，步骤繁琐费时，因此当需要检测的转基因植株较多时，这些方法显得不太适用。在植物领域也有一些快速提取DNA的方法报道。然而，所有这些建立在碱液裂解基础上的快速提取方法模板在进行PCR之前都需要进行加热/煮沸或者加入中和液(TE或者Tris-HCl)进行中和。这一些额外的步骤显然会增加样品之间的交叉污染，样品多时也会耗费大量时间。
技术实现思路
根据以上现有技术的不足，本专利技术提供一种烟草叶组织PCR模板的制备方法，该方法使用仪器少，样品消耗少，快速、简便、成本低，没有交叉污染，能够在短时间内处理大量样品。本专利技术所述的一种烟草叶组织PCR模板的制备方法，其特征在于：以NaOH溶液为提取液，将提取液与植物叶片组织放入到离心管中，直接在磨样机上磨样，得到的上清液直接作为模板进行PCR反应。其中优选方案如下：所述的NaOH溶液的摩尔浓度为0.01mol/L～0.1mol/L，更优选为0.01mol/L。所述的磨样机的工作转速频率为20～25Hz，磨样时间为1.5～3min，更优选为工作转速频率23Hz，磨样时间2min。综上所述，本专利技术可以按照以下步骤进行：将直径0.25mm的钢珠和250μL摩尔浓度为0.01mol/L的NaOH溶液加入2mL的离心管中，再取8～12mm2植物叶片组织放入，然后在磨样机上以23Hz频率磨样2分钟，取1μL上清液即可直接作为模板进行PCR反应。应用本专利技术制备方法得到的模板进行PCR扩增程序：PCR扩增体系采用20μL反应体系，包括2×PCRMix10μL，前引物和后引物各6pmol，DNA模板1μL，用ddH2O补齐体积。PCR扩增程序如下：94℃条件下预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，36个循环；最后72℃延伸10min。取6μLPCR产物在150V电压，1.5％琼脂糖凝胶中电泳15min检测扩增情况。凝胶用EB进行染色，凝胶成像系统拍照分析。本专利技术所具有的优点在于：(1)建立了一种快速高效的制备转基因烟草样品DNA的方法，此方法采用0.01mol/L的NaOH溶液为提取液，破碎转基因烟草叶片组织后无需经过加热煮沸中和等步骤，上清液可直接用作PCR反应的模板；(2)用此方法制备的DNA模板PCR扩增结果稳定、准确、重复性好，与传统SDS提取法和试剂盒提取法获得的DNA相比，PCR结果没有明显差异；(3)该方法还可以应用于小麦、高粱、水稻、玉米等作物上，同样取得了很好的实验效果；(4)该方法使用仪器少，样品消耗少，快速、简便、成本低，没有交叉污染，能够在短时间内处理大量样品，因此能够对大量的转基因烟草样品进行DNA的快速提取和鉴定。附图说明图1为实施例1中采用不同浓度NaOH溶液制备DNA模板进行PCR扩增的电泳分析图(图中：M：Trans2KDNAMarker；1：1mol/LNaOH溶液；2：0.5mol/LNaOH溶液；3：0.25mol/LNaOH溶液；4：0.1mol/LNaOH溶液；5：0.05mol/LNaOH溶液；6：0.01mol/LNaOH溶液；7：0.001mol/LNaOH溶液)；图2为实施例3中采用不同品牌PCRMix进行PCR扩增的电泳分析图(图中：M：Trans2KDNAMarker；1：全式金AS111PCRMix；2：ThermoScientificK1081PCRMix；3：擎科梓熙TSE004PCRMix；4：MDBioP002PCRMix；A：引物Ntab0067020-SF/Ntab0067020-S扩增结果；B：引物Ntab0104030-SF/Ntab0104030-SR扩增结果)；图3为实施例4中采用不同DNA提取方法进行PCR扩增的电泳分析比较图(图中：M：Trans2KDNAMarker；1：Ntab0733630-SF/Ntab0733630-SR扩增结果；2：Ntab0774310-SF/Ntab0774310-SR扩增结果；3：Ntab0067020-SF/Ntab0067020-SR扩增结果；4：Ntab0104030-SF/Ntab0104030-SR扩增结果；A：SDS方法提取DNA模板；B：实施例2方法提取DNA模板)；图4为实施例5中通过Crispr-Cas9技术编辑的烟草木糖基转移酶基因Ntab0067020和Ntab0104030的阳性植株进行PCR扩增的电泳分析图(图中：M：Trans2KDNAMarker；1-2：非转基因K326对照；3-6：Crispr-Cas9载体阳性但gDNA未编辑植株；7-8：Crispr-Cas9载体阳性且gDNA编辑植株，A：Crispr-Cas9技术编辑Ntab0067020基因植株；B：Crispr-Cas9技术编辑Ntab0104030基因植株)；图5为实施例5中A1，A3，A7，A8植株的测序结果(图中黑色阴影显示的为Crispr-Cas9技术编辑的基因靶点序列)；图6为实施例5中B1，B3，B7，B8植株的测序结果(图中黑色阴影显示的为Crispr-Cas9技术编辑的基因靶点序列)；图7为实施例6中不同作物应用不同DNA提取方法进行PCR扩增的电泳分析比较图(图中：M：Trans2KDNAMarker；1：小麦；2：高粱；3：烟草；4：棉花；5：水稻；6：玉米，A：试剂盒法提取DNA；B：实施例2所述的方法提取D本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种烟草叶组织PCR模板的制备方法，其特征在于：以NaOH溶液为提取液，将提取液与植物叶片组织放入到离心管中，直接在磨样机上磨样，得到的上清液直接作为模板进行PCR反应。

【技术特征摘要】
1.一种烟草叶组织PCR模板的制备方法，其特征在于：以NaOH溶液为提取液，将提取液与植物叶片组织放入到离心管中，直接在磨样机上磨样，得到的上清液直接作为模板进行PCR反应。2.根据权利要求1所述的一种烟草叶组织PCR模板的制备方法，其特征在于：所述的NaOH溶液的摩尔浓度为0.01mol/L～0.1mol/L。3.根据权利要求2所述的一种烟草叶组织PCR模板的制备方法，其特征在于：所述的NaOH溶液的摩尔浓度为0.01mol/L。4.根据权利要求1所述的一种烟草叶组织PCR模板的制备方法，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：孔英珍，徐宗昌，王萌，石大川，
申请(专利权)人：中国农业科学院烟草研究所，
类型：发明
国别省市：山东;37