从植物样品中分离核酸的方法技术

本发明专利技术提供一种从植物样品中分离核酸的方法，包括：(a)制备裂解样品，其中制备包括：(i)通过在包含至少一种离液剂和一个或多个固体破碎颗粒的裂解溶液中机械破碎植物样品来裂解植物样品，以及(ii)任选地澄清裂解物；(b)使裂解样品与至少一种蛋白质沉淀剂和至少一种抑制剂去除剂接触并提供混合物；(c)从混合物中获得液相；以及(d)从液相中分离核酸。还提供一种用于该方法的试剂盒。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】从植物样品中分离核酸的方法
技术介绍
从植物分离核酸可以是非常具有挑战性的，其原因在于植物细胞难以裂解的性质以及存在着包括多糖和多酚化合物在内的大量抑制剂。此外，这些参数在植物种类和同一植物的不同部分之间可能会大幅变化。这经常导致分离出少量的低品质核酸、如DNA。最常用的植物样品裂解方法是研钵和研杵，或用普通研磨介质(即金属或玻璃珠)进行机械破碎。当使用这种标准程序时，产量通常较低，并且取决于样品种类，DNA包括大量抑制剂的存在。因此，存在对于可用于广谱的植物种类的经过改进的裂解和去除抑制剂的需求。为了从植物中分离核酸、如DNA，通常采用的方法是将研钵和研杵与CTAB裂解缓冲液组合使用，用于植物材料的裂解和抑制剂的去除。研钵和研杵的使用非常耗时，效率低下，并且难以与多个样品一起使用。CTAB是有毒的试剂。市售的试剂盒将研钵和研杵、或球形陶瓷或金属珠的某些组合，与离液缓冲液和基于去污剂的缓冲液一起使用来进行裂解。这些方法的缺点是它们本质上是非标准的，不能应用于多种不同植物种类并获得类似的成功。这通常导致产量降低，抑制剂的存在增加以及(就研钵和研杵的情况而言)实验的耗时。需要用于从植物样品中分离核酸、特别是DNA的改进方法。特别是，需要针对多种植物样品种类来提高核酸产量和去除抑制剂的方案。
技术实现思路
根据第一方面，提供一种从植物样品中分离核酸的方法，包括：(a)制备裂解样品，其中制备包括：(i)通过在包含至少一种离液剂和一个或多个固体破碎颗粒的液体裂解组合物中机械破碎植物样品来裂解植物样品，以及(ii)任选地澄清裂解物；(b)使裂解样品与至少一种蛋白质沉淀剂和至少一种抑制剂去除剂接触并提供混合物；(c)从混合物中获得液相；以及(d)从液相中分离核酸。根据第二方面，提供一种从植物样品中分离核酸的试剂盒，所述试剂盒包括：(i)至少一种离液剂，优选选自硫氰酸钠、碳酸钠、硫氰酸铵、硫氰酸钾、硫氰酸锂、高氯酸锂、硫酸胍及其组合；(ii)至少一种磷酸盐；(iii)至少一种固体破碎颗粒；(iv)至少一种沉淀剂，优选选自乙酸铵、硫酸铵、乙酸钾、乙酸钠、氯化钠、乙酸铯及其组合；(v)至少一种抑制剂去除剂，优选选自氯化铝、硫酸铝、乙酸铒(III)、氯化铒(III)、氯化钬、氯化锆(IV)、氯化铪(IV)、硫酸铝铵、十二水合硫酸铝铵、硫酸铝钾、水合氯化铝、氧化钙、氯化铁(III)、硫酸铁(II)、铝酸钠、硅酸钠、氯化镁及其组合。根据第三方面，本公开涉及根据第二方面的试剂盒在根据第一方面的方法中的用途。本专利技术的技术允许从各种植物样品中以高产量分离高品质的核酸、如DNA。如实施例所证明，本技术允许从不同种类的植物样品中以高产量分离无抑制剂的高品质DNA。本技术改进了植物材料的裂解，因此改善了核酸从植物样品中的释放，从而提高了核酸产量。此外，用本方法去除抑制剂非常有效，从而确保分离的核酸是高品质的。如通过实施例所进一步证明的，本专利技术的方法可应用于多种不同植物种类并获得类似的成功。因此，本专利技术提供用于多种植物样品种类的通用方法，该方法允许以高产量和纯度分离核酸、特别是DNA。因此，本专利技术对本领域做出了重要贡献。由以下描述和所附权利要求书，本申请的其他方面、目的、特征和优点对于本领域技术人员来说将变得显而易见。然而，应理解，以下描述、所附权利要求书和具体实施例尽管示出了本申请的优选实施方式，但是仅以示例的方式给出。具体实施方式与例如使用研钵和研杵以及通过用常规研磨介质进行机械破碎的标准程序相比，本专利技术对从植物样品(包括叶、茎、种子、根和针)中提取核酸、如DNA进行了改进。本申请表明，使用用于植物样品裂解的优化的化学方法与研磨介质的选择组合将允许对各种植物样品进行有效、快速和完全的匀浆。与本领域的标准技术相比，产量和抑制剂的去除得到了显著改善。本专利技术将新的裂解化学方法与相对较大和较重的固体装置(球锥(ballcone)或类似物)组合使用，以有效地将各种植物样品匀浆，随后引入特定的抑制剂去除步骤以提供高品质DNA。本文提供的方法从植物样品中分离核酸，并从分离的核酸中去除抑制剂，从而允许对分离的核酸进行有效的下游分析。该方法提高了多种植物样品种类的核酸产量和抑制剂的去除。根据第一方面，提供一种从植物样品中分离核酸的方法，包括：(a)制备裂解样品，其中制备包括：(i)通过在包含至少一种离液剂和一个或多个固体破碎颗粒的液体裂解组合物中机械破碎植物样品来裂解植物样品，以及(ii)任选地澄清裂解物；(b)使裂解样品与至少一种蛋白质沉淀剂和至少一种抑制剂去除剂接触并提供混合物；(c)从混合物中获得液相；以及(d)从液相中分离核酸。根据第二方面，提供一种从植物样品中分离核酸的试剂盒，所述试剂盒包括：(i)至少一种离液剂，优选选自硫氰酸钠、碳酸钠、硫氰酸铵、硫氰酸钾、硫氰酸锂、高氯酸锂、硫酸胍及其组合；(ii)至少一种磷酸盐；(iii)至少一种固体破碎颗粒；(iv)至少一种沉淀剂，优选选自乙酸铵、硫酸铵、乙酸钾、乙酸钠、氯化钠、乙酸铯及其组合；(v)至少一种抑制剂去除剂，优选选自氯化铝、硫酸铝、乙酸铒(III)、氯化铒(III)、氯化钬、氯化锆(IV)、氯化铪(IV)、硫酸铝铵、十二水合硫酸铝铵、硫酸铝钾、水合氯化铝、氧化钙、氯化铁(III)、硫酸铁(II)、铝酸钠、硅酸钠、氯化镁及其组合。根据第三方面，本公开涉及根据第二方面的试剂盒在根据第一方面的方法中的用途。在以下描述中，本文提供的任何范围包括该范围内的所有值。还应注意的是，术语“或”通常以包括“和/或”的含义使用(即，意指替代物中的一个、两个或它们的任意组合)，除非上下文中另有说明。并且，在本说明书和所附权利要求书中所用的单数形式“一个”，“一种”和“该”包括多个指示物，除非上下文中另有说明。术语“包括”、“具有”、“包含”和它们的变体被同义地使用并且被解释为非限制性的。本文所用术语“其组合之一”是指该术语之前的所列项目的所有可能的组合之一。例如，“A、B、C或其组合之一”旨在指代以下任何一种：A、B、C、AB、AC、BC或ABC。类似地，本文所用术语“其组合”是指该术语之前的所列项目的所有可能的组合。例如，“A、B、C或其组合”旨在指代以下所有：A、B、C、AB、AC、BC和ABC。根据第一方面的方法根据第一方面，提供一种从植物样品中分离核酸的方法，包括：(a)制备裂解样品，其中制备包括：(i)通过在包含至少一种离液剂和一个或多个固体破碎颗粒的液体裂解组合物中机械破碎植物样品来裂解植物样品，以及(ii)任选地澄清裂解物；(b)使裂解样品与至少一种蛋白质沉淀剂和至少一种抑制剂去除剂接触并提供混合物；(c)从混合物中获得液相；以及(d)从液相中分离核酸。现在将详本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种从植物样品中分离核酸的方法，包括：/n(a)制备裂解样品，其中制备包括：/n(i)通过在包含至少一种离液剂和一个或多个固体破碎颗粒的液体裂解组合物中机械破碎植物样品来裂解植物样品，/n(ii)任选地澄清裂解物；/n(b)使裂解样品与至少一种蛋白质沉淀剂和至少一种抑制剂去除剂接触并提供混合物；/n(c)从混合物中获得液相；以及/n(d)从液相中分离核酸。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180427 EP 62/664,028;20180511 EP 18171963.4;20181.一种从植物样品中分离核酸的方法，包括：
(a)制备裂解样品，其中制备包括：
(i)通过在包含至少一种离液剂和一个或多个固体破碎颗粒的液体裂解组合物中机械破碎植物样品来裂解植物样品，
(ii)任选地澄清裂解物；
(b)使裂解样品与至少一种蛋白质沉淀剂和至少一种抑制剂去除剂接触并提供混合物；
(c)从混合物中获得液相；以及
(d)从液相中分离核酸。


2.如权利要求1所述的方法，其中一个或多个破碎颗粒是非球形的，并且其中一个或多个破碎颗粒的表面包含第一部分并包含第二部分，由此第一部分和第二部分通过形成边缘而相遇。


3.如权利要求2所述的方法，其中第一部分是截头圆锥体的表面并且第二部分是截头圆锥体的表面，其中两个圆锥体均以其较大的底部彼此抵靠，在较大的底部相遇处形成边缘，较大的底部优选具有相同直径。


4.如权利要求2或3所述的方法，其中一个或多个破碎颗粒具有以下一个或多个特征：
(i)破碎颗粒具有由球或椭圆的一块或一部分组成的子部分；
(ii)破碎颗粒具有至少一个尖端，其优选是截头圆锥体；
(iii)破碎颗粒具有至少两个由球或椭圆的一块或一部分组成的子部分；
(iv)一个或多个破碎颗粒具有选自圆锥体、圆柱体、立方体、三角形、矩形、球锥和卫星的形状。


5.如权利要求2～4中一项或多项所述的方法，其中一个或多个破碎颗粒选自具有以下特征的颗粒的组：
(aa)该颗粒包括至少一个尖端，该尖端是截头圆锥体，其中提供尖端的截头圆锥体的较大的底部抵靠在第二部分的截头圆锥体的较小的底部上，并且其中颗粒包括由球或椭圆的一块或一部分组成的子部分，该子部分抵靠在第一部分的截头圆锥体的较小的底部上，其中优选地，由球或椭圆的一块或一部分组成的子部分是半球；
(bb)该颗粒包括至少两个尖端，其中两个尖端都是截头圆锥体，其中截头圆锥体的较大的底部抵靠在第一部分的截头圆锥体的较小的底部上，并且截头圆锥体的较大的底部抵靠在第二部分的截头圆锥体的较小的底部上；
(cc)该颗粒包括两个子部分，其中每个子部分由球或椭圆的一块或一部分组成，其中由球或椭圆的一块或一部分组成的第一子部分抵靠在第一部分的截头圆锥体的较小的底部上，并且由球或椭圆的一块或一部分组成的第二子部分抵靠在第二部分的截头圆锥体的较小的底部上；
(dd)该颗粒包括两个半球，其中第一半球抵靠在第一部分的截头圆锥体的较小的底部上，并且第二半球抵靠在第二部分的截头圆锥体的较小的底部上。


6.如权利要求1～5中一项或多项所述的方法，其中在步骤(a)(i)中使用的至少一个破碎颗粒(aa)其重量在500mg～1000mg、任选地为600mg～900mg的范围内，并且(bb)其具有3mm～10mm、任选地为3mm～7mm或4mm～7mm的尺寸，其中优选地，破碎颗粒是球锥。


7.如权利要求1～6中一项或多项所述的方法，其中：
(i)离液剂选自硫氰酸钠、硫氰酸钾、硫氰酸铵、硫氰酸锂及其组合，其中优选地，离液剂是硫氰酸钠；和/或
(ii)液体裂解组合物和/或裂解混合物中的至少一种离液剂的浓度在0.75M～1.5M和优选0.8～1.25M的范围内，其中优选地，离液剂是NaSCN。


8.如权利要求1～7中一项或多项所述的方法，其中该方法还包括在步骤(b)中使裂解样品与至少一种抑制剂去除剂接触之前，添加至少一种磷酸盐，其中优选地，至少一种磷酸盐在步骤(a)中添加。


9.如权利要求8所述的方法，其中至少一种磷酸盐包括在裂解组合物中，该裂解组合物优选为裂解溶液，并且其中液体裂解组合物、裂解混合物和/或裂解样品中的至少一种磷酸盐的浓度在0.05～0.75M的范围内，任选地选自0.06M～0.6M、0.075M～0.5M、0.1M～0.3M，并且优选地在0.1～0.25M或0.15M～0.2M或更优选0.125M～0.2M的范围内。


10.如权利要求1～9中一项或多项所述的方法，其中液体裂解组合物包含硫氰酸钠和至少一种磷酸盐，优选磷酸氢二钠，其中优选地，液体裂解组合物和/或液体裂解混合物以选自0.75M～1.5M和0.8～1.25M的浓度包含硫氰酸钠，并且以选自0.075M～0.3M、0.1～0.25M和0.1M～0.2M的浓度包含至少一种磷酸盐，优选磷酸氢二钠。


11.如权利要求1～10中一项或多项所述的方法，其中步骤(a)包括实施(ii)澄清裂解物，其中澄清裂解物包括将在将植物样品破碎后得到的裂解混合物分离为固体级分和液体级分，并且其中在步骤(b)中，将裂解混合物的液体级分作为裂解样品进行处理。


12.如权利要求1～11中一项或多项所述的方法，其中：
(aa)至少一种蛋白质沉淀剂选自乙酸铵、硫酸铵、乙酸钾、乙酸钠、氯化钠和乙酸铯，其中优选使用乙酸铵，和/或其中混合物中的至少一种沉淀剂的浓度在选自0.1～4M、0.2M～3M、0.3M～2.5M、0.4M～2.25M、0.5M～2M和0.6M～1.75M的范围内；
(bb)至少一种抑制剂去除剂选自氯化铝、乙酸铒(III)、氯化铒(III)、氯化钬、氯化铪(IV)、氯化锆(IV)、硫酸胍及其组合，其中优选地，抑制剂去除剂是三价铝盐，更优选氯化铝，和/或其中混合物中的至少一种抑制剂去除剂的浓度在选自1～150mM、5mM～125mM、10mM～100mM、15mM～75mM和20mM～65mM的范围内。


13.如权利要求1～12中一项或多项所述的方法，其中在步骤(b)中，裂解样品与包含至少一种沉淀剂和至少一种抑制剂去除剂的组合物接触，其中所述组合物优选为液体组合物，更优选液体溶液，并且其中所述组合物具有以下一个或多个特征：
(aa)在步骤(b)中添加的组合物中的一种或多种沉淀剂的总浓度在0.5M～10M、1～8M或1.5～7.5M、优选1M～6M、1.5M～5.5M、2M～5M、2.5～4.5M和3M～4M的范围内；
(bb)在步骤(b)中添加的组合物中的一种或多种抑制剂去除剂的总浓度在10～500mM、25mM～400mM、50mM～350mM、75mM～300mM、90mM～250mM、优选50mM或100mM～200mM、例如50mM～175mM或75mM～150mM的范围内；
(cc)其包含以下组分、基本上由以下组分构成、或者由以下组分构成：
(i)一种或多种沉淀剂，选自乙酸铵、硫酸铵、乙酸钾、乙酸钠、氯化钠、乙酸铯及其组合；
(ii)一种或多种抑制剂去除剂，选自氯化铝、乙酸铒(III)、氯化铒(III)、氯化钬、氯化铪(IV)、氯化锆(IV)及其组合；以及
(iii)任选的水。


14.如权利要求1～13中一项或多项所述的方法，其中在步骤(a)(i)中使用至少两种固体破碎颗粒，其中：
(i)由一个或多个尺寸至少为1.5mm的破碎颗粒来提供第一类型，并且
(ii)由多个尺寸为1mm或更小的破碎颗粒来提供第二类型。


15.如权利要求14所述的方法，其中第一类型具有如权利要求2～6中任一项所限定、优选地如权利要求5或6所限定的破碎颗粒的一个或多个特征。


16.如权利要求14或15所述的方法，其中第二类型具有以下一个或多个特征：
(i)多个颗粒基本上是球形的，并且包含以下物质或者由以下物质构成：锆、锆石(硅酸锆)、氧化锆(二氧化锆)、钇稳定的锆、石英、氧化铝、碳化硅、陶瓷、玻璃(例如二氧化硅玻璃或二氧化硅)或上述物质的组合；
(ii)多个颗粒的尺寸在0.05mm～0.9mm的范围内，任选地选自0.07mm～0.8mm、0.08mm～0.75mm和0....

【专利技术属性】
技术研发人员：D·奥尼尔，P·史密斯，
申请(专利权)人：恰根有限公司，
类型：发明
国别省市：德国;DE