低抗原性细胞的制造方法技术

一种制造方法，所述制造方法是由供体细胞制造向受体进行同种异体移植时的排斥反应被降低的低抗原性细胞的方法，所述制造方法包括：分别确定上述供体细胞以及上述受体的人白细胞抗原(Human Leukocyte Antigen)(HLA)等位基因；特定不存在于上述受体中而存在于上述供体细胞中的HLA等位基因；以及，对已特定的上述HLA等位基因进行破坏或改变，得到包含没有表达对上述供体细胞特异的HLA蛋白质的细胞的细胞群，没有表达对上述供体细胞特异的HLA蛋白质的细胞为上述低抗原性细胞。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】低抗原性细胞的制造方法
本专利技术涉及低抗原性细胞的制造方法。更具体而言，涉及低抗原性细胞的制造方法、低抗原性细胞的检测用试剂盒、细胞、gRNA、以及目标碱基序列的特定方法。本申请基于2018年2月16日在日本申请的日本特愿2018-026421号主张优先权，在此引用其内容。
技术介绍
在将供体的细胞向他人即受体(患者)移植的同种异体移植时，由于免疫反应，移植细胞被排斥。为了区分细胞的自我与非自我而发挥最重要作用的是被称为HLA(HumanLeukocyteAntigen、人白细胞抗原)或主要组织相容性基因复合体(Majorhistocompatibilitycomplex、MHC)的细胞表面蛋白质。HLA分为I类和II类。I类的HLA蛋白质在体内的大部分种类的细胞中表达。I类的HLA蛋白质与β2-微球蛋白(β2-Microglobulin)(B2M)形成异质二聚体(heterodimer)，表达至细胞表面，具有将肽呈递至CD8阳性细胞毒性T细胞并诱导激活的功能。呈递的抗原肽是内源性的，多数具有8～10氨基酸的长度。分类为HLAI类的是以HLA-A基因、HLA-B基因、HLA-C基因、HLA-E基因、HLA-F基因、HLA-G基因为主的6个基因。此外，也已知多个假基因(HLA-H、HLA-J、HLA-K、HLA-L、HLA-P、HLA-T、HLA-U、HLA-V、HLA-W、HLA-X、HLA-Y等)。这些中，特别是在个人之间的序列多样性大的是HLA-A基因、HLA-B基因、HLA-C基因这三个，它们对在移植免疫中识别自我与非自我发挥主要的作用。II类的HLA蛋白质主要在巨噬细胞、树突状细胞、活性化T细胞、B细胞等免疫细胞中表达。II类的HLA蛋白质的α链和β链形成异质二聚体，具有将肽呈递至CD4辅助T细胞进行诱导激活的功能。呈递的抗原肽是外因性的，多数具有15～24氨基酸的长度。分类为HLAII类的是HLA-DR(α链:HLA-DRA、β链:HLA-DRB)、HLA-DQ(α链:HLA-DQA1、β链:HLA-DQB1)、HLA-DP(α链:HLA-DPA1或HLA-DPA2、β链:HLA-DPB1或HLA-DPB2)。此外，已知也存在多个假基因(HLA-DMA、HLA-DMB、HLA-DOA、HLA-DOB)。HLA基因由于其序列多样性而在细胞水平上参与自我和非自我的识别。同种异体移植时，为了减轻免疫排斥，HLA的匹配也非常重要。例如，在造血干细胞移植中，推荐找出HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DR的两个等位基因、即总计8个等位基因中的抗原性尽可能一致的供体进行移植。另外有报道指出，从肾脏移植等的存活率的成绩来看，HLA抗原性的一致度越高，植入效率也明显高。另一方面，也存在由于在细胞表面不存在HLA抗原而诱导的免疫系统。NK细胞表达多个抑制性受体。例如，已知识别HLA-E并抑制NK细胞的作用的CD94与NKG2A的复合受体，在发现不存在HLA-E的细胞时，诱导NK细胞的激活进行攻击。另外，也存在被称为KIR(杀伤细胞免疫球蛋白样受体，KillercellImmunoglobulin-likeRecepter)的受体家族，根据胞外域的个数，分类为2D和3D，除此之外，根据胞内域的长度，分成L(长)和S(短)。已知2DL1受体识别HLA-C2，2DL2以及2DL3受体识别HLA-C1，2DL4受体识别HLA-G，3DL1识别HLA-Bw4，3DL2识别HLA-A3或HLA-A11，从而抑制NK细胞的活性。KIR中具有多型，例如有报道指出日本人几乎全部(98％以上)具有2DL1、2DL3、3DL4，但具有2DL2很稀少，为15％左右。另外，iPS细胞、ES细胞等多能干细胞具有能够分化成各种细胞类型的多功能性，因此，在将多能干细胞分化成各种细胞后向患者移植的、细胞治疗和/或再生医疗备受瞩目。实际上，已报道了如下例：由ES细胞分化成神经细胞、并移植至骨髓损伤患者的例子；由iPS细胞分化成视网膜色素上皮细胞、并移植至老年性黄斑改性患者的例子，等。具有如下报道:将上述来自多能干细胞的细胞移植时，使移植的细胞与患者的HLA型一致也很重要。但是，多能干细胞的建立需要很大的成本和时间，因此具有难以对每个患者准备HLA型一致的细胞的问题。作为解决该问题的方法，例如在专利文献1中记载了一种细胞，该细胞使对I类的HLA蛋白质的细胞表面呈递所必要的B2M基因缺失。近年来，通过使用CRISPR-Cas9以及导向RNA(gRNA)的基因组编辑技术，gRNA的目标碱基序列依赖地在基因组DNA中诱导双链DNA切割(Doublestrandbreak、DSB)，从而削除基因组DNA的一部分，或者，将与双链DNA切割诱导部位附近具有部分相同序列的模板DNA与Cas9以及gRNA共导入，从而能够插入任意的DNA片段。但是，基因组编辑技术中的DSB诱导，取决于如下碱基序列，该碱基序列为：对目标序列进行识别结合的gRNA的20碱基左右的间隔碱基序列和3～5碱基左右的PAM序列。因此，只要gRNA的碱基序列与目标部位的碱基序列不一致，则难以进行高效的DSB诱导。另外，在目标部位以外也存在与目标部位的碱基序列非常相似的碱基序列、例如仅仅1碱基不同的碱基序列时，已知存在错误地在目标部位以外的部位也诱导DSB、诱导不期望的基因组序列突变的风险，即，所谓的脱靶突变风险。现有技术文献专利文献专利文献1:国际公开第2012/145384号
技术实现思路
专利技术所要解决的课题专利文献1中记载的细胞由于缺失B2M基因，所以I类的HLA蛋白质不能呈递在细胞表面。因此，可以认为进行同种异体移植时的免疫反应被抑制。但是，如果HLA蛋白质无法呈递至细胞表面，则细胞的抗原呈递能力丧失。细胞如果失去抗原呈递能力，则在B2M缺陷细胞受到病毒等的感染时或发生肿瘤时等，无法呈递来自病毒或肿瘤的抗原，结果有可能有助于病毒以及肿瘤的繁殖。另外，对于HLA蛋白质没有呈递至细胞表面的细胞，会被识别“失去自我(missingself)”的NK细胞攻击。因此，认为使用基因组编辑技术仅仅选择性地破坏任意的HLA基因。但是，HLA基因存在多个，另外包括很多假基因，在相互的HLA基因之间序列的相同性高。另一方面，即使是相同的HLA基因，个体间的序列多样性也大，因此，即使鉴定出与某HLA基因序列匹配的目标碱基序列，其也不一定能在来自其他供体的细胞中使用。因此，确定基因组编辑的适当的目标序列并不容易。另外，以往的基因组编辑技术中，要花费大量的时间查找进行目标基因组编辑的细胞。本专利技术的目的在于，提供制造在向受体进行同种异体移植时的排斥反应被降低的低抗原性细胞的技术。用于解决课题的技术手段本专利技术包括以下方案。[1]一种制造方法，该制造方法是由供体细胞制造在向受体进行同种异体移植时的排斥反应被降低的低抗原性细胞的方法，该制造方法包括：分别本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种制造方法，所述制造方法是由供体细胞制造向受体进行同种异体移植时的排斥反应被降低的低抗原性细胞的方法，/n所述制造方法包括：/n分别确定所述供体细胞以及所述受体的人白细胞抗原(HLA)等位基因；/n特定在所述受体中不存在、而所述供体细胞中存在的HLA等位基因；和/n对已特定的所述HLA等位基因进行破坏或改变，得到包含没有表达对所述供体细胞特异的HLA蛋白质的细胞的细胞群，/n没有表达对所述供体细胞特异的HLA蛋白质的细胞为所述低抗原性细胞。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180216 JP 2018-0264211.一种制造方法，所述制造方法是由供体细胞制造向受体进行同种异体移植时的排斥反应被降低的低抗原性细胞的方法，
所述制造方法包括：
分别确定所述供体细胞以及所述受体的人白细胞抗原(HLA)等位基因；
特定在所述受体中不存在、而所述供体细胞中存在的HLA等位基因；和
对已特定的所述HLA等位基因进行破坏或改变，得到包含没有表达对所述供体细胞特异的HLA蛋白质的细胞的细胞群，
没有表达对所述供体细胞特异的HLA蛋白质的细胞为所述低抗原性细胞。


2.根据权利要求1所述的制造方法，其中，在分别确定所述供体细胞以及所述受体的所述HLA等位基因中所确定的所述HLA等位基因包括HLA-A等位基因、HLA-B等位基因以及HLA-C等位基因。


3.根据权利要求1或2所述的制造方法，其中，在得到包含没有表达对所述供体细胞特异的HLA蛋白质的细胞的细胞群后，还包括：从所述细胞群中回收没有表达对所述供体细胞特异的HLA蛋白质的细胞，
所述回收包括：
使HLA蛋白质表达诱导剂与所述细胞群接触；和
将在已与所述HLA蛋白质表达诱导剂接触的所述细胞群中的对所述供体细胞特异的HLA蛋白质的表达作为指标，从所述细胞群中回收没有表达对所述供体细胞特异的HLA蛋白质的细胞。


4.根据权利要求3所述的制造方法，其中，所述HLA蛋白质表达诱导剂为干扰素(IFN)-γ、IFN-α、IFN-β、白介素(IL)-4、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、转化生长因子(TGF)-α或TGF-β。


5.根据权利要求1～4中任一项所述的制造方法，其中，所述低抗原性细胞为多能干细胞。


6.一种在向受体进行同种异体移植时的排斥反应被降低的低抗原性细胞的检测用试剂盒，其中，包含HLA蛋白质表达诱导剂。


7.根据权利要求6所述的试剂盒，其中，所述HLA蛋白质表达诱导剂为IFN-γ、IFN-α、IFN-β、IL-4、GM-CSF、TGF-α或TGF-β。


8.根据权利要求6或7所述的试剂盒，其中，所述低抗原性细胞为多能干细胞。


9.一种HLA蛋白质表达诱导剂，其由IFN-γ、IFN-α、IFN-β、IL-4、GM-CSF、TGF-α或TGF-β构成。


10.一种细胞，其中，至少一种HLA等位基因被破坏或改变，且所述细胞能够表达至少一种HLA蛋白质。


11.根据权利要求10所述的细胞，其中，所述HLA等位基因包括HLA-A等位基因、HLA-B等位基因或HLA-C等位基因。


12.根据权利要求10或11所述的细胞，其是在向受体进行同种异体移植时的排斥反应被降低的低抗原性细胞，已被破坏或改变的所述HLA等位基因为在所述受体中不存在的HLA等位基因。


13.根据权利要求10～12中任一项所述的细胞，其为多能干细胞。


14.根据权利要求10～13中任一项所述的细胞，其中，进一步破坏或改变II类主要组织相容性复合物反式激活因子(CIITA)等位基因、调节因子X5(RFX5)等位基因、调节因子X相关蛋白(RFXAP)等位基因以及调节因子X相关锚蛋白(RFXANK)等位基因中至少一种等位基因。


15.根据权利要求10～14中任一项所述的细胞，其中，HLA-A等位基因以及HLA-B等位基因被破坏，且所述细胞能够表达至少一种HLA-C蛋白质。


16.根据权利要求15所述的细胞，其中，所述HLA-C蛋白质是由选自HLA-C*01:02等位基因、HLA-C*02:02等位基因、HLA-C*03:03等位基因、HLA-C*03:04等位基因、HLA-C*04:01等位基因、HLA-C*05:01等位基因、HLA-C*06:02等位基因、HLA-C*07:01等位基因、HLA-C*07:02等位基因、HLA-C*08:01等位基因、HLA-C*12:02等位基因以及HLA-C*16:01等位基因中的一种等位基因编码的蛋白质。

【专利技术属性】
技术研发人员：堀田秋津，徐淮耕，金子新，王博，
申请(专利权)人：国立大学法人京都大学，
类型：发明
国别省市：日本;JP