稳定且副作用少的基因组编辑用复合物和编码该复合物的核酸制造技术

本发明专利技术提供一种复合物，其为核酸序列识别模块与蛋白降解标签结合而得的复合物，所述核酸序列识别模块与双链DNA中的靶核苷酸序列特异性地结合，所述蛋白降解标签由(i)在C末端包含疏水性氨基酸的3个残基的肽或(ii)在C末端包含该氨基酸残基的至少一部分被丝氨酸取代的氨基酸的3个残基的肽构成。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】稳定且副作用少的基因组编辑用复合物和编码该复合物的核酸
本专利技术涉及稳定且副作用少的基因组编辑用复合物和编码该复合物的核酸、以及使用了该复合物的基因组编辑方法。
技术介绍
无需进行选择标记基因的整合、即可将对相同操纵子中的下游基因的表达的影响抑制在最小限度的这样的基因组编辑在原核生物中特别有利。源自噬菌体的RecET和λ-Red重组酶被用作重组技术，使依赖于供体DNA或寡核苷酸的同源性的整合/取代容易进行(例如非专利文献1)。通过与缺损了甲基定向性错配修复(MMR)的菌株组合，无需整合选择标记，即可实现高效率的重组(非专利文献2)，在几天内会产生多个靶基因座中的遗传多态性，因此在多重自动基因组工程学方法(MAGE)中应用。然而，上述重组技术依赖于MMR的缺损、或作为重组DNA修复系统的中心构成要素的RecA这样的宿主依赖性因子，会给作为用于克隆的宿主而使用的大部分大肠杆菌带来危害，因此无法容易地转用到背景不同的细菌种(非专利文献3)。已知成簇的规律间隔短回文重复序列(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats：CRISPR)和CRISPR相关(Cas)蛋白通过以依赖于单一向导RNA(sgRNA)和原间隔序列临近基序(PAM)的方式切割靶DNA而起到细菌的适应免疫系统的作用。源自酿脓链球菌(Streptococcuspyogenes)的Cas9核酸酶在具有DNA双链切割(DSB)的修复途径的真核生物中被广泛用作强效的基因组编辑工具(例如非专利文献4、5)。在通过非同源末端结合(NHEJ)途径进行的DSB修复中，向靶DNA中导入小的插入和/或缺失(indels：插入/缺失)，产生位点特异性突变或基因破坏。虽然效率依赖于宿主细胞，但为了更准确的编辑，通过提供包含针对靶区的同源臂的供体DNA，可促进同源重组修复(HDR)。然而，由于目前的基因组编辑技术依赖于宿主的DNA修复系统，所以对于其在原核生物中的应用需要进一步研究。在大部分的细菌中，因缺乏NHEJ途径，通过利用人工核酸酶进行的DNA切割而发生细胞死亡(非专利文献6、7)。因此，CRISPR/Cas9仅被用作用通过λ-Red重组系统这样的其他方法用于基因已被修饰的细胞的反选择子(counter-selector)(例如非专利文献8、9)。最近，由脱氨酶介导的靶碱基编辑得到证实，其通过靶基因座直接编辑核苷酸，而无需使用包含针对靶区的同源臂的供体DNA(例如专利文献1、非专利文献10～12)。该技术是利用DNA脱氨基化代替由核酸酶介导的DNA切割，因此不会诱导细菌的细胞死亡，可适用于细菌的基因组编辑，但其突变效率、特别是同时对多处进行编辑的效率还谈不上充分。现有技术文献专利文献专利文献1：国际公开第2015/133554号；非专利文献非专利文献1：Datsenko,K.A.&Wanner,B.L.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.97,6640-5(2000)；非专利文献2：Costantino,N.&Court,D.L.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.100,15748-53(2003)；非专利文献3：Wang,J.等人,Mol.Biotechnol.32,43-53(2006)；非专利文献4：Mali,P等人,Science339,823-827(2013)；非专利文献5：Cong,L等人,Science339,819-823(2013)；非专利文献6：Bowater,R.&Doherty,A.J.,PLoSGenet.2,93-99(2006)；非专利文献7：Cui,L.&Bikard,D.,NucleicAcidsRes.44,4243-4251(2016)；非专利文献8：Jiang,W等人,NatBiotechnol31,233-239(2013)；非专利文献9：Li,Y等人,Metab.Eng.31,1-9(2015)；非专利文献10：Komor,A.C等人,Nature61,5985-91(2016)；非专利文献11：Nishida,K等人,Science102,553-563(2016)；非专利文献12：Ma,Y等人,Nat.Methods1-9(2016).doi:10.1038/nmeth.4027。
技术实现思路
专利技术所要解决的课题以往的基因组编辑用载体因由该载体表达且作用于宿主的基因组DNA的性质的基因组编辑用复合物的毒性高，故对宿主、特别是细菌而言负担大，可导致载体在宿主内变得不稳定。在基因组编辑中，会产生发生非特异性突变或脱靶突变等副作用，特别是在使用尿嘧啶DNA糖基化酶抑制剂(UGI)等提高了突变效率的情况下，作为其代价，对宿主产生强毒性，引起细胞死亡或非特异性突变率的上升等。因此，本专利技术的课题在于：提供即使在宿主内也可稳定地扩增的毒性低的载体等核酸和该核酸所编码的基因组编辑用复合物；以及提供基因组编辑的方法，该方法使用该载体、必要时使用核酸修饰酶，不依赖于RecA这样的宿主依赖性因子，可适用于广范围的细菌，可在抑制非特异性突变等的同时修饰细菌的DNA。用于解决课题的手段本专利技术人得到了以下想法：通过抑制对作为宿主的细菌而言毒性高的基因组编辑用复合物在细菌内的存在量，可使细菌中的载体变得稳定，也许还可减少细菌DNA的非特异性突变等。于是，为了抑制基因组编辑用复合物的存在量，着眼于已知在细菌中促进蛋白的降解、且缩短半衰期的蛋白降解标签的LVA标签，对其进行了研究。其结果证实了：通过在基因组编辑用复合物中添加该蛋白降解标签，可在维持对靶位点的突变效率的同时减少非特异性突变，另外，即使在组合了UGI的情况下，也可减少非特异性突变，能够以高效率修饰靶序列(图9、图10)。本专利技术人根据这些见解进一步反复研究，结果完成了本专利技术。即，本
技术实现思路
如下。[1]复合物，其为核酸序列识别模块与蛋白降解标签结合而得的复合物，所述核酸序列识别与双链DNA中的靶核苷酸序列特异性地结合，所述蛋白降解标签由(i)在C末端包含疏水性氨基酸的3个残基的肽或(ii)在C末端包含该氨基酸残基的至少一部分被丝氨酸取代的氨基酸的3个残基的肽构成。[2][1]所述的复合物，上述复合物为进一步结合有核酸修饰酶的复合物，其中，将靶向位点的1个以上的核苷酸转换成其他的1个以上的核苷酸或使其缺失、或者在该靶向位点插入1个以上的核苷酸。[3][1]或[2]所述的复合物，其中，上述氨基酸的3个残基为亮氨酸-缬氨酸-丙氨酸、亮氨酸-丙氨酸-丙氨酸、丙氨酸-丙氨酸-缬氨酸或丙氨酸-丝氨酸-缬氨酸。[4][1]～[3]中任一项所述的复合物，其中，上述核酸序列识别模块为Cas的2个DNA切割能力中的仅一方、或两方的DNA切割能力失活的CRISPR-Cas系统。[5][本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.复合物，其为核酸序列识别模块与蛋白降解标签结合而得的复合物，所述核酸序列识别模块与双链DNA中的靶核苷酸序列特异性地结合，所述蛋白降解标签由(i)在C末端包含疏水性氨基酸的3个残基的肽或(ii)在C末端包含该氨基酸残基的至少一部分被丝氨酸取代的氨基酸的3个残基的肽构成。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20171122 JP 2017-2252211.复合物，其为核酸序列识别模块与蛋白降解标签结合而得的复合物，所述核酸序列识别模块与双链DNA中的靶核苷酸序列特异性地结合，所述蛋白降解标签由(i)在C末端包含疏水性氨基酸的3个残基的肽或(ii)在C末端包含该氨基酸残基的至少一部分被丝氨酸取代的氨基酸的3个残基的肽构成。


2.权利要求1所述的复合物，上述复合物为进一步结合有核酸修饰酶的复合物，其中，将靶向位点的1个以上的核苷酸转换成其他的1个以上的核苷酸或使其缺失、或者在该靶向位点插入1个以上的核苷酸。


3.权利要求1或2所述的复合物，其中，上述氨基酸的3个残基为亮氨酸-缬氨酸-丙氨酸、亮氨酸-丙氨酸-丙氨酸、丙氨酸-丙氨酸-缬氨酸或丙氨酸-丝氨酸-缬氨酸。


4.权利要求1～3中任一项所述的复合物，其中，上述核酸序列识别模块为Cas的2个DNA切割能力中的仅一方、或两方的DNA切割能力失活的CRISPR-Cas系统。


5.权利要求1～3中任一项所述的复合物，其中，上述复合物为CRISPR-Cas系统与蛋白降解标签结合而得的复合物。


6.权利要求2～4中任一项所述的复合物，其中，上述核酸修饰酶为核酸碱基转换酶或DNA糖基化酶。


7.权利要求6所述的复合物，其中，上述核酸碱基转换酶为脱氨酶。


8.权利要求6或7所述的复合物，该复合物进一步结合有碱基切除修复抑制剂。


9.核酸，该核酸编码权利要求1～8中任一项所述的复合物。


10.修饰细菌的双链DNA的靶向位点、或在该位点附近调控双链DNA所编码的基因的表达的方法，该方法包括以下步骤：使核酸序列识别模块与蛋白降解标签结合而得的复合物、与该双链DNA接触，所述核酸序列识别模块与所选择...

【专利技术属性】
技术研发人员：西田敬二，
申请(专利权)人：国立大学法人神户大学，
类型：发明
国别省市：日本;JP