具有蓝色系花色的转化植物及其制作方法技术

本发明专利技术提供一种具有蓝色系花色的转化植物或其自殖或者他殖后代或者它们的营养繁殖体、植物体的一部分、组织或细胞。本发明专利技术使花翠素型花色素苷和黄酮C‑糖苷在花瓣中共表达。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】具有蓝色系花色的转化植物及其制作方法
本专利技术涉及一种方法，其为具有蓝色系花色的转化植物的制作方法，其特征在于，使花翠素型花色素苷(anthocyanin)和黄酮C-糖苷在植物的细胞内共存，以及涉及一种以花翠素型花色素苷和黄酮C-糖苷在细胞中共存为特征的转化植物或其自殖或者他殖后代或者它们的营养繁殖体、植物体的一部分(特别是切花)或其加工品(特别是切花的加工品)、组织或细胞。
技术介绍
蔷薇、菊花、康乃馨等为世界性产业上重要的花卉。尤其蔷薇为最受欢迎的花卉植物，有从公元前开始就已经进行栽培的记录，跨越数百年经历了人为的品种改良。然而，由于在可杂交的近缘种中没有蓝色系的花色的野生种等问题，在以往的杂交育种、突变育种中制作具有蓝色系花色的蔷薇品种存在困难。全新的蓝色系花色的创造，伴随花卉的利用场合的扩大而唤起的新需要，且关系到生产或消费的扩大。于是，尝试了通过基因工程的方法创造具有蓝色系花色的蔷薇。例如，已知在由紫色至蓝色的花中，富含花翠素、矮牵牛素及二甲花翠素等花翠素型花色素苷，然而由于蔷薇等花卉无法生产这样的花翠素型花色素苷，因此正在进行通过使对于他们的合成为必须的类黄酮3’,5’-氧化酶基因表达，而人为地生产花翠素的研究(非专利文献1)。然而，即使为了在转基因植物中使生产目标物质的酶基因进行表达而人为地改变植物的代谢，常常由于与植物自身拥有的内在酶的竞争，目标物质的累积完全或者几乎不发生。进一步，花色除了根据花色素苷自身的结构，还根据共存的类黄酮(称作辅色素)或金属离子、液泡的pH等而变化。黄酮或黄酮醇为代表性的辅色素，通过与花色素苷堆积成三明治状，具有使花色素苷变蓝，看起来浓的效果(非专利文献2)。已知这是辅色素效果。尤其已知黄酮表现出强辅色素效果，例如报告称在转基因康乃馨的分析中黄酮表现出显著的辅色素效果(非专利文献3)。此外，报告称在荷兰鸢尾中，相对于总花翠素量的总黄酮量的比越高越表现出辅色素效果，颜色越蓝(非专利文献4)。然而，并不是所有的植物都能够生产黄酮，蔷薇或矮牵牛等并不累积黄酮。从而，正在进行使编码具有由黄烷酮合成黄酮的活性的蛋白质的基因在这样的植物中表达进而改变花色的尝试(专利文献1)。此外，已知在植物中，黄酮除游离状态以外还以糖苷的形式分布，主要生成黄酮O-糖苷和黄酮C-糖苷，而特别是黄酮C-糖苷表现出强辅色素效果。例如，报告称作为黄酮C-糖苷的一种的异牡荆素，在花菖蒲(IrisensataThunb.)中对于花色素苷表现出辅色素效果，通过对花色素苷进行稳定化，可使蓝色花色稳定化(非专利文献5)。关于黄酮C-糖苷，至今为止报告有2个生物合成路径，其一为通过黄烷酮2-氧化酶及C-糖苷酶、脱水酶催化的反应由黄烷酮合成。另一个为通过黄酮合成酶及黄酮C-糖苷酶催化的反应由黄烷酮合成(非专利文献6)。然而，至今为止还没有将这些基因导入不生产黄酮C-糖苷的植物的例子。此外，认为辅色素效果受花色素苷和黄酮的量的比、花色素苷及黄酮中基于糖或酰基的修饰等的影响，仅仅使黄酮合成酶基因表达，使其仅累积黄酮，未必能够将花色变蓝。若在矮牵牛中使蝴蝶草的黄酮合成酶基因表达，则蓝紫色的花色会变淡(非专利文献7)。此外，使来自龙胆的黄酮合成酶基因在烟草中表达时，虽然合成黄酮(非专利文献8)，但花色仍会变淡。进一步，通过人为地使其含有黄酮及二甲花翠素来改变蔷薇的花色的尝试正在进行(专利文献2)，然而尚未成功制造具有蓝色系花色的蔷薇。实际上，在至今为止的以蓝色系花色为目标的蔷薇的花色改变中，紫色(RHS色谱标准下色相组：Purple组)或蓝紫色(Purple-Violet组，Violet组)有界限，无法制作具有紫蓝色(Violet-Blue组)或蓝色(Blue组)的花色的蓝色的蔷薇。然而，依然期望一种蓝色表达控制技术的开发，使具有真正蓝色的花色的蔷薇的创作成为可能。现有技术文献专利文献专利文献1：日本特开2000-279182号公报专利文献2：国际公开第2008/156206号非专利文献非专利文献1：Tanaka2006PhytochemistryReviews5,283-291非专利文献2：Goto(1987)Prog.Chem.Org.Natl.Prod.52非专利文献3：Fukuietal.Phytochemistry,63,15-23,2003非专利文献4：Mizunoetal.PlantPhysiol.Bioch.201372,116-124非专利文献5：Yabuyaetal.Euphytica2000115,1-5非专利文献6：Sasakietal.FEBSLett.2015589,182-187非专利文献7：Tsudaetal.PlantBiotechnology,21,377-386,2004非专利文献8：Nakatukaetal.2006,MolecularBreeding17:91-99
技术实现思路
本专利技术要解决的课题在于提供一种具有蓝色系花色的转化植物或其自殖或者他殖后代或者它们的营养繁殖体、植物体的一部分、组织或细胞。本申请专利技术者们，为了解决上述课题进行了深入研究，重复进行实验结果发现，若使花翠素型花色素苷和黄酮C-糖苷在蔷薇等植物的花瓣中共存，则可获得以往未曾获得的具有蓝色系花色(RHS色谱标准第5版：Violet-Blue组/Blue组且/或色相角度：339.7°～270.0°)的转化植物，从而完成了本专利技术。本专利技术如以下所示。[1]一种方法，其用于制作转化植物，其特征在于，使花翠素型花色素苷和黄酮C-糖苷在植物的细胞内共存。[2]根据1所述的方法，其特征在于，所述黄酮C-糖苷选自黄酮6-C-糖苷、黄酮8-C-糖苷及他们的组合。[3]根据2所述的方法，其特征在于，所述黄酮C-糖苷为芹菜素6-C-糖苷及/或木犀草素6-C-糖苷。[4]根据1～3中任一项所述的方法，其特征在于，所述花翠素型花色素苷选自二甲花翠素3,5-二糖苷、花翠素3,5-二糖苷、矮牵牛素3,5-二糖苷、酰化花色素苷(例如，花翠素3-(6”-对香豆酰基-β-葡萄糖基)-5-β-糖苷或花翠素3-(6”-对丙二酰基-β-葡萄糖基)-3’,5’-β-二糖苷)及他们的组合。[5]根据1～4中任一项所述的方法，其特征在于，包含通过含有黄酮合成酶基因，即FNS基因或其同源基因及黄酮C-糖苷酶基因，即CGT基因或其同源基因的载体对宿主植物进行转化。[6]根据5所述的方法，其特征在于，所述载体进一步含有类黄酮F3’5’氧化酶基因，即F3’5’H基因或其同源基因及甲基转移酶基因，即MT基因或其同源基因。[7]根据6所述的方法，其特征在于，所述FNS基因或其同源基因选自，(1-a)多聚核苷酸，由序列号19的碱基序列构成；(1-b)多聚核苷酸，为在严谨条件下与由与序列号19的碱基序列互补的碱基序列构成的多聚核苷酸进行杂交、且与(1-本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种方法，其用于制作转化植物，其特征在于，使花翠素型花色素苷和黄酮C-糖苷在植物的细胞内共存。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20171003 JP 2017-1934801.一种方法，其用于制作转化植物，其特征在于，使花翠素型花色素苷和黄酮C-糖苷在植物的细胞内共存。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述黄酮C-糖苷选自黄酮6-C-糖苷、黄酮8-C-糖苷及他们的组合。


3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述黄酮C-糖苷为芹菜素6-C-糖苷及/或木犀草素6-C-糖苷。


4.根据权利要求1～3之任一项所述的方法，其特征在于，所述花翠素型花色素苷选自二甲花翠素3,5-二糖苷、花翠素3,5-二糖苷、矮牵牛素3,5-二糖苷、酰化花色素苷及他们的组合。


5.根据权利要求1～4之任一项所述的方法，其特征在于，包含通过含有黄酮合成酶基因，即FNS基因或其同源基因及黄酮C-糖苷酶基因，即CGT基因或其同源基因的载体对宿主植物进行转化。


6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述载体进一步含有类黄酮F3’5’氧化酶基因，即F3’5’H基因或其同源基因及甲基转移酶基因，即MT基因或其同源基因。


7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述FNS基因或其同源基因选自，
(1-a)多聚核苷酸，由序列号19的碱基序列构成；
(1-b)多聚核苷酸，为在严谨条件下与由与序列号19的碱基序列互补的碱基序列构成的多聚核苷酸进行杂交、且与(1-a)中所述的多聚核苷酸编码具有同样活性的蛋白质的多聚核苷酸；
(1-c)多聚核苷酸，编码由序列号20的氨基酸序列构成的蛋白质；
(1-d)多聚核苷酸，编码由在序列号20的氨基酸序列中1个或多个氨基酸缺失、取代、插入及/或附加而得的氨基酸序列构成的蛋白质，且与(1-c)中所述的多聚核苷酸编码具有同样活性的蛋白质；
(1-e)多聚核苷酸，编码具有相对于序列号20的氨基酸序列具有90％以上的一致性的氨基酸序列的蛋白质，且与(1-c)中所述的多聚核苷酸编码具有同样活性的蛋白质，
所述CGT基因或其同源基因选自，
(2-a)多聚核苷酸，由序列号21的碱基序列构成；
(2-b)多聚核苷酸，为在严谨条件下与由与序列号21的碱基序列互补的碱基序列构成的多聚核苷酸进行杂交、且与(2-a)中所述的多聚核苷酸编码具有同样活性的蛋白质的多聚核苷酸；
(2-c)多聚核苷酸，编码由序列号22的氨基酸序列构成的蛋白质；
(2-d)多聚核苷酸，编码由在序列号22的氨基酸序列中1个或多个氨基酸缺失、取代、插入及/或附加而得的氨基酸序列构成的蛋白质，且与(2-c)中所述的多聚核苷酸编码具有同样活性的蛋白质；
(2-e)多聚核苷酸，编码具有相对于序列号22的氨基酸序列具有90％以上的一致性的氨基酸序列的蛋白质，且与(2-c)中所述的多聚核苷酸编码具有同样活性的蛋白质，
所述F3’5’H基因或其同源基因选自，
(3-a)多聚核苷酸，由序列号9的碱基序列构成；
(3-b)多聚核苷酸，为在严谨条件下与由与序列号9的碱基序列互补的碱基序列构成的多聚核苷酸进行杂交、且与(3-a)中所述的多聚核苷酸编码具有同样活性的蛋白质的多聚核苷酸；
(3-c)多聚核苷酸，编码由序列号10的氨基酸序列构成的蛋白质；
(3-d)多聚核苷酸，编码由在序列号10的氨基酸序列中1个或多个氨基酸缺失、取代、插入及/或附加而得的氨基酸序列构成的蛋白质，且与(3-c)中所述的多聚核苷酸编码具有同样活性的蛋白质；
(3-e)多聚核苷酸，编码具有相对于序列号10的氨基酸序列具有90％以上的一致性的氨基酸序列的蛋白质，且与(3-c)中所述的多聚核苷酸编码具有同样活性的蛋白质，且，
所述MT基因或其同源基因选自，
(4-a)多聚核苷酸，由序列号17的碱基序列构成；
(4-b)多聚核苷酸，为在严谨条件下与由与序列号17的碱基序列互补的碱基序列构成的多聚核苷酸进行杂交、且与(4-a)中所述的多聚核苷酸编码具有同样活性的蛋白质的多聚核苷酸；
(4-c)多聚核苷酸，编码由序列号18的氨基酸序列构成的蛋白质；
(4-d)多聚核苷酸，编码由在序列号18的氨基酸序列中1个或多个氨基酸缺失、取代、插入及/或附加而得的氨基酸序列构成的蛋白质，且与(4-c)中所述的多聚核苷酸编码具有同样活性的蛋白质；
(4-e)多聚核苷酸，编码具有相对于序列号18的氨基酸序列具有90％以上的一致性的氨基酸序列的蛋白质，且与(4-c)中所述的多聚核苷酸编码具有同样活性的蛋白质。


8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，在所述CGT基因或其同源基因上附加有来自拟南芥醇脱氢酶基因，即ADH基因的5’非编码区，即5’-UTR，即序列号23。


9.根据权利要求1～4之任一项所述的方法，其特征在于，包含通过含有黄烷酮2-氧化酶基因，即F2H基因或其同源基因、黄酮C-糖苷酶基因，即CGT基因或其同源基因及脱水酶基因，即FDH基因或其同源基因的载体对宿主植物进行转化。


10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述载体进一步含有类黄酮F3’5’氧化酶基因，即F3’5’H基因或其同源基因及甲基转移酶基因，即MT基因或其同源基因。


11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述F2H基因或其同源基因选自，
(5-a)多聚核苷酸，由序列号3的碱基序列构成；
(5-b)多聚核苷酸，为在严谨条件下与由与序列号3的碱基序列互补的碱基序列构成的多聚核苷酸进行杂交、且与(5-a)中所述的多聚核苷酸编码具有同样活性的蛋白质的多聚核苷酸；
(5-c)多聚核苷酸，编码由序列号4的氨基酸序列构成的蛋白质；
(5-d)多聚核苷酸，编码由在序列号4的氨基酸序列中1个或多个氨基酸缺失、取代、插入及/或附加而得的氨基酸序列构成的蛋白质，且与(5-c)中所述的多聚核苷酸编码具有同样活性的蛋白质；
(5-e)多聚核苷酸，编码具有相对于序列号4的氨基酸序列具有90％以上的一致性的氨基酸序列的蛋白质，且与(5-c)中所述的多聚核苷酸编码具有同样活性的蛋白质，
所述CGT基因或其同源基因选自，
(6-a)多聚核苷酸，由序列号13的碱基序列构成；
(6-b)多聚核苷酸，为在严谨条件下与由与序列号13的碱基序列互补的碱基序列构成的多聚核苷酸进行杂交、且与(6-a)中所述的多聚核苷酸编码具有同样活性的蛋白质的多聚核苷酸；
(6-c)多聚核苷酸，编码由序列号14的氨基酸序列构成的蛋白质；
(6-d)多聚核苷酸，编码由在序列号14的氨基酸序列中1个或多个氨基酸缺失、取代、插入及/或附加而得的氨基酸序列构成的蛋白质，且与(6-c)中所述的多聚核苷酸编码具有同样活性的蛋白质；
(6-e)多聚核苷酸，编码具有相对于序列号14的氨基酸序列具有90％以上的一致性的氨基酸序列的蛋白质，且与(6-c)中所述的多聚核苷酸编码具有同样活性的蛋白质，
所述FDH基因或其同源基因选自，
(7-a)多聚核苷酸，由序列号15的碱基序列构成；
(7-b)多聚核苷酸，为在严谨条件下与由与序列号15的碱基序列互补的碱基序列构成的多聚核苷酸进行杂交、且与(7-a)中所述的多聚核苷酸编码具有同样活性的蛋白质的多聚核苷酸；
(7-c)多聚核苷酸，编码由序列号16的氨基酸序列构成的蛋白质；
(7-d)多聚核苷酸，编码由在序列号16的氨基酸序列中1个或多个氨基酸缺失、取代、插入及/或附加而得的氨基酸序列构成的蛋白质，且与(7-c)中所述的多聚核苷酸编码具有同样活性的蛋白质；
(7-e)多聚核苷酸，编码具有相对于序列号16的氨基酸序列具有90％以上的一致性的氨基酸序列的蛋白质，且与(7-c)中所述的多聚核苷酸编码具有同样活性的蛋白质，
所述F3’5’H基因或其同源基因选自，
(8-a)多聚核苷酸，由序列号9的碱基序列构成；
(8-b)多聚核苷酸，为在严谨条件下与由与序列号9的碱基序列互补的碱基序列构成的多聚核苷酸进行杂交、且与(8-a)中所述的多聚核苷酸编码具有同样活性的蛋白质的多聚核苷酸；
(8-c)多聚核苷酸，编码由序列号10的氨基酸序列构成的蛋白质；
(8-d)多聚核苷酸，编码由在序列号10的氨基酸序列中1个或多个氨基酸缺失、取代、插入及/或附加而得的氨基酸序列构成的蛋白质，且与(8-c)中所述的多聚核苷酸编码具有同样活性的蛋白质；
(8-e)多聚核苷酸，编码具有相对于序列号10的氨基酸序列具有90％以上的一致性的氨基酸序列的蛋白质，且与(8-c)中所述的多聚核苷酸编码具有同样活性的蛋白质，且，
所述MT基因或其同源基因选自，
(9-a)多聚核苷酸，由序列号17的碱基序列构成；
(9-b)多聚核苷酸，为在严谨条件下与由与序列号17的碱基序列互补的碱基序列构成的多聚核苷酸进行杂交、且与(9-a)中所述的多聚核苷酸编码具有同样活性的蛋白质的多聚核苷酸；
(9-c)多聚核苷酸，编码由序列号18的氨基酸序列构成的蛋白质；
(9-d)多聚核苷酸，编码由在序列号18的氨基酸序列中1个或多个氨基酸缺失、取代、插入及/或附加而得的氨基酸序列构成的蛋白质，且与(9-c)中所述的多聚核苷酸编码具有同样活性的蛋白质；
(9-e)多聚核苷酸，编码具有相对于序列号18的氨基酸序列具有90％以上的一致性的氨基酸序列的蛋白质，且与(9-c)中所述的多聚核苷酸编码具有同样活性的蛋白质。


12.一种转化植物或其自殖或者他殖后代，其特征在于，花翠素型花色素苷和黄酮C-糖苷共存于细胞内。


13.根据权利要求12所述的转化植物或其自殖或者他殖后代，其特征在于，所述黄酮C-糖苷选自黄酮6-C-糖苷、黄酮8-C-糖苷及他们的组合。


14.根据权利要求13所述的转化植物或其自殖或者他殖后代，其特征在于，所述黄酮C-糖苷为芹菜素6-C-糖苷。


15.根据权利要求12～14之任一项所述的转化植物或其自殖或者他殖后代，其特征在于，所述花翠素型花色素苷选自二甲花翠素3,5-二糖苷、花翠素3,5-二糖苷、矮牵牛素3,5-二糖苷、酰化花色素苷及他们的组合。


16.根据权利要求12～15之任一项所述的转化植物或其自殖或者他殖后代，其特征在于，含有黄酮合成酶基因，即FNS基因或其同源基因及黄酮C-糖苷酶基因，即CGT基因或其同源基因。


17.根据权利要求16所述的转化植物或其自殖或者他殖后代，其特征在于，进一步含有类黄酮F3’5’氧化酶基因，即F3’5’H基因或其同源基因及甲基转移酶基因，即MT基因或其同源基因。


18.根据权利要求17所述的转化植物或其自殖或者他殖后代，其特征在于，所述FNS基因或其同源基因选自，
(1-a)多聚核苷酸，由序列号19的碱基序列构成；
(1-b)多聚核苷酸，为在严谨条件下与由与序列号19的碱基序列互补的碱基序列构成的多聚核苷酸进行杂交、且与(1-a)中所述的多聚核苷酸编码具有同样活性的蛋白质的多聚核苷酸；
(1-c)多聚核苷酸，编码由序列号20的氨基酸序列构成的蛋白质；
(1-d)多聚核苷酸，编码由在序列号20的氨基酸序列中1个或多个氨基酸缺失、取代、插入及/或附加而得的氨基酸序列构成的蛋白质，且与(1-c)中所述的多聚核苷酸编码具有同样活性的蛋白质；
(1-e)多聚核苷酸，编码具有相对于序列号20的氨基酸序列具有90％以上的一致性的氨基酸序列的蛋白质，且与(1-c)中所述的多聚核苷酸编码具有同样活性的蛋白质，
所述CGT基因或其同源基因选自，
(2-a)多聚核苷酸，由序列号21的碱基序列构成；
(2-b)多聚核苷酸，为在严谨条件下与由与序列号21的碱基序列互补的碱基序列构成的多聚核苷酸进行杂交、且与(2-a)中所述的多聚核苷酸编码具有同样活性的蛋白质的多聚核苷酸；
(2-c)多聚核苷酸，编码由序列号22的氨基酸序列构成的蛋白质；
(2-d)多聚核苷酸，编码由在序列号22的氨基酸序列中1个或多个氨基酸缺失、取代、插入及/或附加而得的氨基酸序列构成的蛋白质，且与(2-c)中所述的多聚核苷酸编码具有同样活性的蛋白质；
(2-e)多聚核苷酸，编码具有相对于序列号22的氨基酸序列具有90％以上的一致性的氨基酸序列的蛋白质，且与(2-c)中所述的多聚核苷酸编码具有同样活性的蛋白质，
所述F3’5’H基因或其同源基因选自，
(3-a)多聚核苷酸，由序列号9的碱基序列构成；
(3-b)多聚核苷酸，为在严谨条件下与由与序列号9的碱基序列互补的碱基序列构成的多聚核苷酸进行杂交、且与(3-a)中所述的多聚核苷酸编码具有同样活性的蛋白质的多聚核苷酸；
(3-c)多聚核苷酸，编码由序列号10的氨基酸序列构成的蛋白质；
(3-d)多聚核苷酸，编码由在序列号10的氨基酸序列中1个或多个氨基酸缺失、取代、插入及/或附加而得的氨基酸序列构成的蛋白质，且与(3-c)中所述的多聚核苷酸编码具有同样活性的蛋白质；
(3-e)多聚核苷酸，编码具有相对于序列号10的氨基酸序列具有90％以上的一致性的氨基酸序列的蛋白质，且与(3-c)中所述的多聚核苷酸编码具有同样活性的蛋白质，且，
所述MT基因或其同源基因选自，
(4-a)多聚核苷酸，由序列号17的碱基序列构成；
(4-b)多聚核苷酸，为在严谨条件下与由与序列号17的碱基序列互补的碱基序列构成的多聚核苷酸进行杂交、且与(4-a)中所述的多聚核苷酸编码具有同样活性的蛋白质的多聚核苷酸；
(4-c)多聚核苷酸，编码由序列号18的氨基酸序列构成的蛋白质；
(4-d)多聚核苷酸，编码由在序列号18的氨基酸序列中1个或多个氨基酸缺失、取代、插入及/或附加而得的氨基酸序列构成的蛋白质，且与(4-c)中所述的多聚核苷酸编码具有同样活性的蛋白质；
(4-e)多聚核苷酸，编码具有相对于序列号18的氨基酸序列具有90％以上的一致性的氨基酸序列的蛋白质，且与(4-c)中所述的多聚核苷酸编码具有同样活性的蛋白质。


19.根据权利要求18所述的转化植物或其自殖或者他殖后代，其特征在于，在所述CGT基因或其同源基因上附加有来自拟南芥醇脱氢酶基因，即ADH基因的5’非编码区，即5’-UTR，即序列号23。


20.根据权利要求12～15之任一项所述的转化植物或其自殖或者他殖后代，其特征在于，含有黄烷酮2-氧化酶基因，即F2H基因或其同源基因、黄酮C-糖苷酶基因，即CGT基因或其...

【专利技术属性】
技术研发人员：中村典子，兴津奈央子，田中良和，
申请(专利权)人：三得利控股株式会社，
类型：发明
国别省市：日本;JP