多能干细胞的分化能力的预测方法和用于该预测方法的试剂技术

本发明专利技术提供在多能干细胞处于未分化状态期间即可预测其分化抵抗性的标志物，提供以该标志物的表达为指标快速评价多能干细胞的分化能力的方法。另外，提供以上述分化抵抗性预测标志物的表达为指标探索适于保持多能干细胞的分化能力的培养条件的手段。而且，还提供以上述分化抵抗性预测标志物的表达为指标评价多能干细胞用培养基的方法。人多能干细胞的分化能力的预测方法，该预测方法包括：测定该多能干细胞中的CHD7的表达水平。人多能干细胞用培养基的评价方法，该评价方法包括：测定该人多能干细胞中的CHD7的表达水平。

A method for predicting the differentiation ability of pluripotent stem cells and the reagents used in this method

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】多能干细胞的分化能力的预测方法和用于该预测方法的试剂
本专利技术涉及：多能干细胞的分化能力的预测方法、以及用于该预测方法的试剂和试剂盒。本专利技术还涉及：多能干细胞用培养基的评价方法、以及用于该评价方法的试剂和试剂盒。本专利技术进一步涉及：降低或消除多能干细胞的分化抵抗性的方法。
技术介绍
胚胎干细胞(ESC)和人工多能干细胞(iPSC)是具有以下两个特征的多能干细胞(PSC)：保持着未分化状态进行增殖的能力(自身增殖能力)和感应分化刺激而分化成三胚层谱系(三胚葉系列)的能力(分化能力)。然而，到分化刺激增加为止都无法从外部验证分化能力。而且，PSC是如何停止自身增殖而转换到分化开始的机制及其一系列过程在理解PSC的生物学上是极其重要的，但尚未充分阐明。这个问题在想要利用PSC来源的细胞实施细胞疗法的情况下特别重要。最终的PSC来源的分化细胞制品中包含未分化细胞会带来肿瘤发生的风险。因此，理解分化开始的过程在临床上颇具价值。冈野和山中等人的小组公开了以下的选择方法：由iPSC诱导次级神经球(SecondaryNeurosphere，SNS)，以该SNS中的Nanog基因的表达为指标，选择肿瘤发生风险降低的iPSC来源的分化细胞(专利文献1)。而且，该小组认为：与其说iPSC的分化抵抗性取决于分化诱导条件，不如说其是iPSC克隆所固有的性质，公开了以iPSC来源的SNS中的Nanog基因的表达为指标来评价原始的iPSC的分化抵抗性的方法(专利文献2)。然而，这些方法为了评价分化抵抗性均需要使iPSC暂且分化成SNS，这需要时间和劳力。如果在PSC处于未分化状态期间就找到能够预测分化抵抗性的标志物，则可以快速且简便地提供无肿瘤发生风险的安全的细胞疗法制剂。然而，这样的分化标志物还未见报道。现有技术文献专利文献专利文献1：日本特表2011-530273；专利文献2：日本特表2012-527887。
技术实现思路
专利技术所要解决的课题本专利技术的目的在于：提供在多能干细胞(PSC)处于未分化的状态下能够预测其分化抵抗性的标志物，提供以该标志物的表达为指标快速评价多能干细胞的分化能力的方法。本专利技术的另一目的在于：提供以上述分化抵抗性预测标志物的表达为指标探索适于保持多能干细胞的分化能力的培养条件的手段。本专利技术的又一目的在于：提供以上述分化抵抗性预测标志物的表达为指标评价多能干细胞用培养基的方法。本专利技术的又一目的在于：提供降低或消除多能干细胞的分化抵抗性的方法。用于解决课题的手段PSC若在细胞的长期培养或者iPSC情形的初期化过程期间获得基因异常，则会显示出分化抵抗性。基因异常可以采用最新的测序技术适时进行试验，PSC和细胞疗法中使用的PSC衍生物可以频繁地接受基因检查以排除遗传异常的细胞。然而，即使是具有正常核型的PSC，有时也会因基于培养条件的表观遗传修饰而显示出分化抵抗性，需要通过胚状体(EB)形成测定或细胞因子诱导性分化测定，定期对PSC的分化能力进行试验，以确认PSC的品质。本专利技术人发现了：在实施PSC的EB形成测定的过程中，某特定的培养条件会对ESC和iPSC两者赋予分化抵抗性。即，若使用市售的Essential8培养基(ThermoFisherScientific、以下也称作“Es8”)或者Stem-Partner(注册商标)人iPS/ES细胞培养基(极东制药工业、以下也称作“SPM”)(竹中等人PLoSOne10(6),2015)培养PSC，则会形成EB，但若将该PSC移到市售的ReproFF2培养基(ReproCELL、以下也称作“RFF2”)中进行5传代以上的培养，则丧失分化能力，没有形成EB。若使该PSC返回到Es8或SPM中进一步进行5传代以上的培养，则恢复了分化能力。本专利技术人通过基于主成分分析法(以下也称作PCA)的分析或GeneChip分析，发现了作为与该PSC的分化能力中的可逆变化相关的基因的候选之一的克罗莫结构域解旋酶DNA结合蛋白7(ChromodomainHelicaseDNAbindingProtein7)(以下也称作“CHD7”)。在研究使用了Es8和RFF2的PSC培养给CHD7基因表达带来的效果时，通过使用了RFF2的培养，CHD7基因的表达受到显著抑制，相对于此，若使用Es8进行培养，则PSC中的CHD7基因显示出中度的表达水平。若向使用RFF2培养的PSC中导入CHD7mRNA来上调CHD7，则PSC自发地开始分化，利用维持未分化细胞的培养体系无法支持分化细胞的增殖。另一方面，若向使用Es8培养的PSC中导入CHD7siRNA来下调CHD7，则PSC的分化能力受到一部分抑制。即，明确了：如果CHD7表达没有超过某上限，则PSC可以在未分化状态下增殖，但在表达降低至不足阈值水平的情况下，无法感应分化刺激，具有上限与阈值之间的CHD7表达范围的PSC维持着能够感应分化刺激的特性。本专利技术人由以上结果确认到：以未分化状态下的PSC的CHD7表达水平为指标可以预测该PSC的分化能力/分化抵抗性，从而完成了本专利技术。即，本专利技术如下。[1]人多能干细胞的分化能力的预测方法，该预测方法包括：测定该人多能干细胞中的CHD7的表达水平。[2][1]所述的方法，其特征在于：预测上述CHD7的表达水平在5ng总RNA中为1500拷贝以上的人多能干细胞会感应分化刺激而显示出分化能力。[3][2]所述的方法，其中，上述CHD7的表达水平在5ng总RNA中为2710拷贝以上。[4][2]或[3]所述的方法，其中，上述CHD7的表达水平为使用Essential8培养基或Stem-Partner(注册商标)人iPS/ES细胞培养基进行了5传代以上的培养的人多能干细胞中的表达水平。[5][1]～[4]中任一项所述的方法，其中，上述人多能干细胞为胚胎干细胞或人工多能干细胞。[6]人多能干细胞用培养基的评价方法，该评价方法包括：测定该人多能干细胞中的CHD7的表达水平。[7][6]所述的方法，其中，上述人多能干细胞为使用受试培养基进行了5传代以上的培养的人多能干细胞。[8][6]或[7]所述的方法，其特征在于：在上述CHD7的表达水平在5ng总RNA中为1500拷贝以上的情况下，评价为该受试培养基能够维持人多能干细胞使其感应分化刺激而显示出分化能力。[9][8]所述的方法，其中，上述CHD7的表达水平在5ng总RNA中为2710拷贝以上。[10][6]～[9]中任一项所述的方法，其中，上述人多能干细胞为胚胎干细胞或人工多能干细胞。[11]试剂或试剂盒，其含有能够检测CHD7的表达的物质而形成，用于预测人多能干细胞的分化能力和/或评价人多能干细胞用培养基。[12]人多能干细胞的分化诱导剂，该分化诱导剂是含有编码CHD7的核酸而形成。[13][1]所述的方法，其特征在于：预测为上述CHD7的表达水平与显示出分化抵抗性的人多能干细本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.人多能干细胞的分化能力的预测方法，该预测方法包括：测定该人多能干细胞中的CHD7的表达水平。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170619 JP 2017-120024;20171212 JP 2017-2374201.人多能干细胞的分化能力的预测方法，该预测方法包括：测定该人多能干细胞中的CHD7的表达水平。


2.权利要求1所述的方法，其特征在于：预测为上述CHD7的表达水平在5ng总RNA中为1500拷贝以上的人多能干细胞会感应分化刺激而显示出分化能力。


3.权利要求2所述的方法，其中，上述CHD7的表达水平在5ng总RNA中为2710拷贝以上。


4.权利要求2或3所述的方法，其中，上述CHD7的表达水平为使用Essential8培养基或Stem-Partner(注册商标)人iPS/ES细胞培养基进行了5传代以上的培养的人多能干细胞中的表达水平。


5.权利要求1～4中任一项所述的方法，其中，上述人多能干细胞为胚胎干细胞或人工多能干细胞。


6.人多能干细胞用培养基的评价方法，该评价方法包括：测定该人多能干细胞中的CHD7的表达水平。


7.权利要求6所述的方法，其中，上述人多能干细胞为使用受试培养基进行了5传代以上的培养的人多能干细胞。


8.权利要求6或7所述的方法，其特征在于：在上...

【专利技术属性】
技术研发人员：川真田伸，山本贵子，竹中智惠美，
申请(专利权)人：公益财团法人神户医疗产业都市推进机构，
类型：发明
国别省市：日本;JP