活性型GcMAF的制备方法技术

本发明专利技术的目的在于提供一种更简便且收率高的活性型GcMAF的制备方法。本发明专利技术是一种活性型GcMAF的制备方法，包括在无血清培养基中对导入VDBP表达载体后的宿主细胞进行培养的工序。上述培养优选为浮游培养。另外，本发明专利技术的活性型GcMAF的制备方法的特征还在于，不需要用于切断糖链的酶处理工序。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】活性型GcMAF的制备方法
本专利技术涉及活性型GcMAF的制备方法。
技术介绍
维生素D结合蛋白质(VDBP；VitaminDBindingProtein)是在肝脏中合成并分泌到血液中的糖蛋白质之一。VDBP与维生素D结合，承担着作为血液中的移送载体的功能。另外，还已知具有与从破坏的细胞中漏出的G-肌动蛋白结合而抑制肌动蛋白聚合物使血管腔变窄而堵塞血管腔的功能。上述VDBP也被称为Gc球蛋白，存在一部分的氨基酸不同而糖链结构不同的三种亚型(VDBP1f、VDBP1s、VDBP2)。其中，在VDBP1f(Gc1f)中，在第418(420)个苏氨酸上结合有由在N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)上结合唾液酸和半乳糖而成的三糖构成的O型糖链。结合有由该三糖构成的O型糖链的VDBP是不具有激活巨噬细胞的功能的非活性型，但是若通过在T细胞以及B细胞各自的细胞表面上表达的唾液酸酶以及β半乳糖苷酶的作用去除唾液酸和半乳糖而仅残留GalNAc-O-T418(420)，则成为作为活性型的Gc蛋白衍生的巨噬细胞活化因子(Gcprotein-derivedmacrophageactivatingfactor，GcMAF，以下有时也表述为“活性型GcMAF”)。)，能够激活巨噬细胞(参照非专利文献1以及非专利文献2)。还已知作为该活性型的GcMAF不仅能激活巨噬细胞，还表现出经由血管新生抑制作用的抗肿瘤活性(参照专利文献1)。另一方面，如图1示意性地表示的那样，从非活性型的VDBP向作为活性型的GcMAF的转换工序复杂，在其制备方法中，一般是从血清、血浆中纯化作为非活性型的VDBP并利用唾液酸酶、β半乳糖苷酶进行处理而去除唾液酸和半乳糖从而形成仅残留有GalNAc的作为活性型的GcMAF的方法。但是，这样的以往的方法需要从血清、血浆中纯化非活性型的VDBP的工序、对所得到的VDBP进行酶处理的工序等复杂的多个工序，因此要求更简便且容易的制备方法。现有技术文献专利文献专利文献1：日本特表2003-532682号公报非专利文献非专利文献1：Proc.Natl.Acad.Sci.USA1991,88,8539-8543非专利文献2：AnticancerResearch,2005.25,3689-3696
技术实现思路
专利技术所要解决的问题在这样的状况下，本专利技术的目的在于提供一种更简便且收率高的活性型GcMAF的制备方法。用于解决问题的手段本专利技术的专利技术人为了解决上述问题进行了深入研究的结果是，发现通过在无血清培养基中对导入非活性型VDBP的表达载体后的宿主细胞进行培养，即使不经过用于切断糖链的酶处理工序，也能够高效地制备在第418(420)个苏氨酸(Thr)上仅结合有GalNAc的活性型GcMAF，从而完成了本专利技术。即，本专利技术的主旨如下所述。[1]一种活性型GcMAF的制备方法，其是活性型的Gc蛋白衍生的巨噬细胞活化因子的制备方法，其中，所述制备方法包括在无血清培养基中对导入维生素D结合蛋白质表达载体后的宿主细胞进行培养的工序。[2]根据[1]所述的活性型GcMAF的制备方法，其中，所述培养为浮游培养。[3]根据[1]或[2]所述的活性型GcMAF的制备方法，其中，所述制备方法不包括用于切断糖链的酶处理工序。[4]根据[1]至[3]中任一项所述的活性型GcMAF的制备方法，其中，所述制备方法包括利用维生素D亲和柱的纯化工序。专利技术效果根据本专利技术的活性型GcMAF的制备方法，通过采用使培养细胞表达VDBP的方法，不需要收集血清、血浆等，也容易进行大量制备。另外，也不需要从血清、血浆等中纯化VDBP的工序，进一步地也不需要用于切断糖链的酶处理工序，因此能够以较少的步骤高效且简便地制备活性型GcMAF。根据本专利技术，由于能够容易地大量生产迄今为止难以大量生产的活性型GcMAF，因此能够适宜地使用于以活性型GcMAF为有效成分的医药品、健康食品等领域。附图说明图1是示意性地表示从非活性型的VDBP向活性型GcMAF的转换工序的图。图2是表示使用本专利技术的方法(CHO细胞/无血清培养基/浮游系培养系统)而得到的活性型GcMAF的免疫印迹的结果的图。图3是表示使用本专利技术的方法(CHO细胞/无血清培养基/浮游系培养系统)而得到的活性型GcMAF(维生素D亲和柱纯化后)的SDS-PAGE(CBB染色)和免疫印迹的结果的图。图4是表示对活性型GcMAF合成中的GALANT3(N-乙酰半乳糖胺基转移酶3，N-acetylgalactosaminyltransferase3)表达的影响进行研究的结果的图。图5是表示使用本专利技术的方法(CHO细胞/无血清培养基/浮游系培养系统)而得到的活性型GcMAF的巨噬细胞激活能力的图。图6是表示使用本专利技术的方法(CHO细胞/无血清培养基/浮游系培养系统)而得到的活性型GcMAF的免疫印迹的结果的图。图7是表示使用本专利技术的方法(HEK293细胞/无血清培养基/浮游系培养系统)而得到的活性型GcMAF的免疫印迹的结果的图。图8是表示使用本专利技术的方法(CHO细胞/无血清培养基/浮游系培养系统)而得到的活性型GcMAF(维生素D亲和柱纯化后)的SDS-PAGE(CBB染色)的结果的图。具体实施方式以下，对本专利技术的活性型GcMAF的制备方法进行详细说明。此外，在本说明书中，DNA、载体的制备等的分子生物学方法，只要没有特别说明，可以通过本领域技术人员公知的一般实验书籍中记载的方法或以其为基准的方法来进行。另外，在本说明书中使用的术语，只要没有特别提及，则以在该
中通常使用的意思来进行解释。<活性型GcMAF的制备方法>本专利技术的活性型GcMAF的制备方法的特征在于，包括在无血清培养基中对导入VDBP表达载体后的细胞进行培养的工序，不需要用于切断非活性型VDBP的糖链的酶处理工序。本专利技术的活性型GcMAF的制备方法不是从血浆、血清中对Gc球蛋白进行纯化来制备活性型GcMAF，而是通过在无血清培养基中对导入VDBP表达载体后的细胞进行培养，不需要多个工序就能够简便地制备活性型GcMAF的方法。在本专利技术中，VDBP为维生素D结合蛋白质(VDBP；VitaminDBindingProtein)，也被称为Gc球蛋白、Gc蛋白质，包括糖链结构不同的三种亚型(1f、1s、2)。在VDBP中的任一种亚型中，均具有在作为糖链的中心的N-乙酰半乳糖胺上O-糖苷与半乳糖结合的共通的结构。在1f型亚型中，以O型链结合有在GalNAc上结合半乳糖和唾液酸而成的三糖(参照图1)，在1s型亚型中，以O型链结合有在GalNAc上结合半乳糖和α-甘露糖而成的三糖，在2型亚型中，以O型链结合有在GalNAc上结合半乳糖而成的二糖，上述VDBP包含在本专利技术中。另外，本专利技术中的VDBP来源于动物，优选为来源于哺乳类，例如可列举本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种活性型GcMAF的制备方法，其是活性型的Gc蛋白衍生的巨噬细胞活化因子的制备方法，其中，所述制备方法包括在无血清培养基中对导入维生素D结合蛋白质表达载体后的宿主细胞进行培养的工序。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20171215 JP 2017-2411091.一种活性型GcMAF的制备方法，其是活性型的Gc蛋白衍生的巨噬细胞活化因子的制备方法，其中，所述制备方法包括在无血清培养基中对导入维生素D结合蛋白质表达载体后的宿主细胞进行培养的工序。


2.根据权利要求1所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：锅岛阳一，锅岛曜子，安部千秋，
申请(专利权)人：公益财团法人神户医疗产业都市推进机构，
类型：发明
国别省市：日本;JP