引起内耳发育不全的猪SOX10突变基因及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种引起内耳发育不全的猪SOX10突变基因及其应用，所述猪SOX10突变基因为SOX10基因编码区的第321位碱基胞嘧啶C发生了复制(SOX10 c.321dupC)，该突变可引起内耳发育不全并呈常染色体显性遗传，可用于人内耳发育不全的发病机理、预防、诊断和治疗研究；也可以制备内耳发育不全的疾病动物模型，该模型可用于人内耳发育不全的发病机理、预防、诊断和治疗研究，对内耳发育不全研究具有重要意义。

【技术实现步骤摘要】
引起内耳发育不全的猪SOX10突变基因及其应用
本专利技术属于生物基因检测
，具体涉及一种引起内耳发育不全的猪SOX10突变基因，还涉及该基因的应用。
技术介绍
SOX10[性别决定区盒基因，SRY(sexdeterminingregionY)-box10]位于人类染色体22q13.1区域，cDNA全长1.4kb，含有5个外显子，其中第3、4、5号外显子编码蛋白，包涵466个氨基酸。在不同的物种之间具有高度保守的序列。以单体或二聚体形式参与靶基因的转录调控，影响神经嵴及内耳发育过程。SOX10基因在人内耳胚胎发育早期即开始表达，在成人内耳主要表达于神经嵴来源的黑色素细胞，是内耳发育中的一个关键转录因子。其编码蛋白含有高度保守的高活性组分结构域(high-mobilitygroup，HMGdomain)，其主要功能是特异性识别并结合靶基因的启动子DNA。耳聋是一种常见的严重影响人类生活质量的感觉障碍疾病。据WHO2019年3月资料显示，全世界人口的6.1％，也就是4.66亿人，患有残疾性听力损失(其中有3400万儿童)。预估至2050年，将增加至9亿人(占人口比例的1/10)患有听力损失。耳聋是我国第二大致残疾病，我国也是世界上听力障碍人数最多的国家。据2006年第二次全国残疾人抽样调查显示，全国有听力残疾人2780万，且每年新增3万多聋儿，其中一半以上属于遗传性耳聋。Waardenburg综合征(Waardenburgsyndrome，WS)是由神经嵴细胞源性黑色素细胞发育异常所致，以色素分布异常和耳聋为特征的遗传性疾病，是最常见的综合征型耳聋。目前SOX10基因已被鉴定为WS致病基因，其中2型占15％，4型50％。虹膜异色及感音神经性耳聋为主要表型。SOX10基因突变导致的WS病例发生发育不全的概率明显高于其它基因突变的WS病例，且前庭发育异常比例较高，如前庭池扩大、半规管缺如等。但是由于疾病动物模型的缺乏，导致其致病机制以及遗传效应的研究滞后。目前已有400余种遗传性耳聋动物模型报道，包括遗传工程动物模型、ENU化学诱变动物模型、自发突变动物模型三类。遗传工程耳聋动物模型最多，目前发现的几乎每一个耳聋基因均制备了基因敲除、敲入或敲低的遗传工程小鼠。此外，利用ENU诱变动物基因组发生高通量随机诱变也是制备耳聋动物新模型、发现致聋新基因并揭示耳聋新机制的有效途径，但大多以小型啮齿类哺乳动物(小鼠、大鼠等)为研究材料。除基因修饰耳聋动物模型外，已有5-6个自发突变耳聋动物模型报道，涉及牛、犬、马、猫等不同动物种属，但这些动物模型尚存在一定缺陷。啮齿类动物与人同源关系较大型哺乳动物略远，在发育过程以及遗传模式上不能很好的模拟人类疾病。而牛等大型动物由于繁殖期较长以及克隆技术的限制，不利于科学研究的进行。猪SOX10蛋白与人类SOX10蛋白氨基酸序列高度相似，相似度高达98％。猪是医学实验动物中除灵长类以外和人类进化关系最近的物种。猪耳聋动物模型与人在遗传及疾病特性上更相似，适于外科操作和临床转化研究，其作为大动物模型对于遗传性耳聋的致病机理研究、临床治疗及药物器械评价等具有独特优势。猪耳蜗的大小和形态与人类非常相似；且与人一样，在猪出生时，内耳形态已基本发育成熟，并具备正常听力，而耳科实验常用的鼠类为晚熟动物，出生后内耳需继续发育。因此，猪模型是耳科领域具有良好应用前景的大动物模型。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的之一在于提供引起内耳发育不全的猪SOX10突变基因，可引起猪内耳发育不全、先天性耳聋并呈显性遗传，能够用于人内耳发育不全、先天性耳聋并呈显性遗传的发病机理、预防、诊断和治疗研究；本专利技术的目的之二在于提供一种包含所述猪SOX10突变基因的构建体；本专利技术的目的之三在于提供一种由所述构建体转化受体细胞而得的重组细胞；本专利技术的目的之四在于提供一种制备内耳发育不全疾病动物模型的方法，制成的模型可用于人内耳发育不全、先天性耳聋的发病机理、预防、诊断和治疗研究，本专利技术的目的之五在于提供一种用于预测或诊断人SOX10突变基因引起内耳发育不全的检测试剂。为达到上述目的，本专利技术提供如下技术方案：1、引起内耳的猪SOX10突变基因，所述猪SOX10突变基因为第321位碱基C发生了复制，导致SOX10蛋白第108位赖氨酸突变为谷氨酰胺，并且移码44个氨基酸之后提前终止。2、一种包含所述猪SOX10突变基因的构建体。3、一种由所述构建体转化受体细胞而得的重组细胞。4、一种制备内耳发育不全疾病动物模型的方法，所述动物为猪，所述猪SOX10基因cDNA序列的第321位碱基C发生复制。5、一种用于预测或诊断人SOX10突变基因引起内耳发育不良的检测试剂，所述检测试剂根据所述的猪SOX10突变基因制成，所述人SOX10突变基因为人SOX10基因第312位C被复制。优选的，所述检测试剂为SEQIDNO：12和SEQIDNO：13所示的引物制成的PCR试剂或测序试剂。本专利技术的有益效果在于：本专利技术定位了猪SOX10c.321dupC点突变可引起内耳发育不全并呈显性遗传，因此可以利用该突变用于人内耳发育不全的发病机理、预防、诊断和治疗研究；也可以制备由点突变引起的内耳发育不全并呈显性遗传的疾病动物模型，该模型可用于人内耳发育不全的发病机理、预防、诊断和治疗研究；猪SOX10蛋白与人类SOX10蛋白氨基酸序列高度相似，相似度高达98％，利用该突变制备耳聋动物模型，在研究耳聋的发病机理上准确度更高，对于耳聋疾病的预防、诊断和治疗具有重大的临床指导意义。附图说明为了使本专利技术的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本专利技术作优选的详细描述，其中：图1为研究Cas9基因编辑系统引起的同源重组突变效率所获得的突变个体序列；图2为SOX10进行基因修饰的序列变化(下划线所示序列为sgRNA序列，下划线所示C为发生了复制的胞嘧啶C)；图3为野生型巴马香猪与突变巴马香猪的SOX10基因Sanger测序的核苷酸序列以及翻译的氨基酸序列；图4为不同物种间的SOX10蛋白HMG功能域序列的比对结果；图5野生型巴马香猪与突变巴马香猪的毛色和听力ABR检测情况；图6为野生型巴马香猪耳蜗micro-CT扫描与3D重建的结果；图7为杂合突变巴马香猪耳蜗火棉胶切片HE染色结果(虚线框所示为不同倍数下猪耳蜗切片结果，显示完整的Corti氏器结构，依次为10倍、20倍、40倍；箭头所示为内耳内毛细胞与外毛细胞)；图8为野生型巴马香猪与杂合突变巴马香猪耳蜗基底膜扫描电镜结果；图9为检测SOX10蛋白功能的荧光报告基因实验结果和核定位实验结果；图10为检测SOX10基因表达量的ddPCR实验结果以及western结果(A为ddPCR实验中所用到的SOX10引物以及特异性探针；B为SOX10基因c.321dupC杂合突变体中SOX10基因表达量的检测结果；C为野生型巴马香猪以及c.321dupC杂合突变猪耳蜗中S本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种引起内耳发育不全的猪SOX10突变基因，其特征在于，所述SOX10突变基因为猪SOX10基因cDNA序列的第321位碱基C发生了复制，所述猪SOX10基因的核苷酸基因如SEQ IDNO：1所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种引起内耳发育不全的猪SOX10突变基因，其特征在于，所述SOX10突变基因为猪SOX10基因cDNA序列的第321位碱基C发生了复制，所述猪SOX10基因的核苷酸基因如SEQIDNO：1所示。


2.一种构建体，其特征在于，包含权利要求1所述的猪SOX10突变基因。


3.一种重组细胞，其特征在于，是由权利要求2所述的构建体转化受体细胞而得。


4.一种制备内耳发育不全疾病动物模型的方法，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：林婷婷，王勇，刘传宏，罗力华，郭维维，任巍，
申请(专利权)人：中国人民解放军陆军军医大学，
类型：发明
国别省市：重庆;50