CRISPR-Cas9特异性敲除猪Fah、Rag2双基因的方法技术

为了解决猪Fah、Rag2双基因敲除效率低、筛选困难的问题，本发明专利技术提供了一组Fah、Rag2双基因的靶序列，以及它们在CRISPR‑Cas9特异性敲除猪Fah、Rag2双基因的用途。本发明专利技术还提供了一种CRISPR‑Cas9敲除猪Fah、Rag2双基因的方法。通过验证，本发明专利技术可以有效实现猪Fah、Rag2双基因的敲除，其双敲除效率高达50％，筛选也十分简单。

【技术实现步骤摘要】
CRISPR-Cas9特异性敲除猪Fah、Rag2双基因的方法
本专利技术涉及基因编辑领域，尤其涉及一种CRISPR-Cas9特异性敲除猪Fah、Rag2双基因的方法。
技术介绍
我国是肝病大国，是世界上病毒性肝炎和肝癌发病率最高、患者最多的国家。目前，全国慢性肝病患者3000万人，每年死于肝癌的病人50多万，每年用于肝病的治疗费用达1000亿元人民币。肝移植仍是目前治疗肝功能衰竭最有效的手段，但供体的短缺和移植后终生免疫抑制剂治疗严重地限制了肝移植在临床上的应用。寻找全肝或部分肝移植的替代治疗方案是临床的迫切需求。因此，肝细胞移植(Hepatocytetransplantation，HT)、生物人工肝(Bioartificialliver，BAL)及组织工程肝脏(Tissueengineeredliver，TEL)等作为肝移植的替代、过渡支持或补充手段引起广泛关注，临床医生希望通过这些支持治疗手段使病人能够通过肝再生自行恢复而避免进行肝移植。研究者将人源肝细胞植入Fab和Rag2基因双敲除(Fah-/-Rag2-/-)的小鼠体内，使人源肝细胞快速增殖，并逐渐替换掉小鼠自身肝细胞，以期获得更多有功能的肝细胞。前述的基因中，Fah编码的延胡索酰乙酰乙酸水解酶是酪氨酸分解代谢的关键的酶，缺失Fah基因会引起严重的肝损伤，致使肝细胞凋亡；而Rag2基因的缺失可能导致V(D)J的重排缺陷，导致严重的联合免疫缺陷(SCID)，减少小鼠对人肝细胞的排斥反应。人源肝细胞由于具有代谢酪氨酸的能力，在免疫力低下的Fah-/-Rag2-/-小鼠体内免受免疫系统的清除，逐渐增殖，代替小鼠肝细行使功能。按照这个原理，每只小鼠产生的人肝细胞少于1×108个，不足以用作肝细胞移植和生物人工肝治疗。而猪在解剖，生理病理学，营养代谢和疾病特征等方面都与人类相似度更高，根据生物安全性、生理功能指标等多方面评价，基因修饰猪已然成为疾病发生机制，病理毒理研究，异种细胞再生系统，异种器官来源等多方面的重要动物模型。若使用Fah-/-Rag2-/-的猪代替Fah-/-Rag2-/-的小鼠，则可提供足量的干细胞用于肝细胞移植和生物人工肝治疗。CRISPR-Cas9技术是一种新型的基因组靶向修饰技术，可以对生物体基因组特异位点进行定点改造，比起传统基因编辑技术(如同源重组技术、类转录激活效应子核酸酶技术、锌指核酸酶技术等)有着操作简单、成本低等优势，但由于其脱靶率较高，且十分依赖精确的sgRNA靶序列设计。通常情况下，CRISPR-Cas9技术进行基因敲除，其单等位基因敲除率可能达到80％以上，但双等位基因敲除成功率在10％以内。例如：J-TKang的研究中，对猪纤维原细胞的RUNX3基因进行CRISPR-Cas9敲除，其双等位基因突变率仅有7.8％(GeneratonofRUNX3knockoutpigsusingCRISPR/Cas9-mediatedgenetargeting.ReprodDomAnim2016；51：970-978)。目前尚未见报道使用该技术对猪的Fah和Rag2基因进行双敲除。
技术实现思路
为了解决上述问题，本专利技术提供了一种CRISPR-Cas9特异性敲除猪Fah基因的靶序列，所述序列如SEQIDNO.17所示。本专利技术还提供了一种CRISPR-Cas9特异性敲除猪Rag2基因的靶序列，所述序列如SEQIDNO.51所示。本专利技术还提供了权利要求1或2所述靶序列在构建Fah、Rag2双基因敲除的猪细胞中的用途。本专利技术还提供了一种CRISPR-Cas9特异性敲除猪Fah、Rag2双基因的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)合成两种靶序列双链分子，分别连接入CRISPR-sgRNA空表达载体；(2)使用腺病毒包装带有靶序列的CRISPR-sgRNA表达载体，得重组腺病毒；(3)将前述重组病毒转入表达Cas9蛋白的猪细胞；(4)挑取细胞单克隆，鉴定基因敲除效果；所述靶序列如SEQIDNO.17和51所示；所述空表达载体接入所述靶序列双链分子后能表达出完整的sgRNA。前述的方法中，步骤(1)所述的连接是粘性末端连接；所述双链分子带有接头序列，用于双链分子与载体的连接。进一步地，步骤(1)所述的接头序列为：靶序列5’端的接头序列：CACCG；靶序列反向互补序列的5’端的接头序列：AAAC；靶序列反向互补序列的3’端的接头序列：C；前述序列的方向是5’到3’。前述的方法中，步骤(1)所述两种靶序列双链分子所接入的载体分别带有两种不同的荧光信号基因。前述的方法中，步骤(3)之后、步骤(4)之前还包括如下步骤：使用流式细胞仪筛选同时带有两种荧光信号的细胞。优选地，前述方法步骤(1)所述CRISPR-sgRNA空表达载体是pHBAD-U6-gRNA质粒。前述的方法中，步骤(4)所述鉴定是酶切鉴定或测序鉴定。本专利技术具有以下有益效果：首先，本专利技术的靶序列设计合理、选取得当，Fah或Rag2双等位基因除效率可达100％，其中，Fah和Rag2双敲除效率高达50％。其次，本专利技术引入荧光基因辅助基因编辑细胞的筛选，使基因敲除细胞的筛选变得直观、快速。本专利技术提供了猪Fah、Rag2双基因敲除的CRISPR-Cas9靶基因和对应方法，可以直接应用在Fah-/-Rag2-/-猪的培育中，在人源肝细胞增殖应用上，有着良好的前景。显然，根据本专利技术的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本专利技术上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。以下通过具体实施方式对本专利技术的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本专利技术上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本专利技术上述内容所实现的技术均属于本专利技术的范围。附图说明图1是表1中第17号靶序列对应的基因编辑示意图。图2是表2中第1号靶序列对应的基因编辑示意图。图3是pHBAD-U6-gRNA-GFP载体结构图。图4是pHBAD-U6-gRNA-RFP载体结构图。图5是pHBLV-gRNA-Cas9-Puro载体结构图。图6是荧光显微镜检测PIEC细胞系中的Fah-sgRNA和Rag2-sgRNA转染的荧光图：左上，自然光下视野；右上，GFP荧光视野；左下，RFP荧光视野；右下，GFP和RFP融合视野；标尺，100μm。图7是流式细胞仪分选图。图8是T7E1酶切电泳图：左图，Fah基因；右图，Rag2基因；M，marker；WT，野生型。图9是双阳性细胞单克隆的荧光图：左上，自然光下视野；右上，GFP荧光视野；左下，RFP荧光视野；右下，GFP和RFP融合视野；标尺，100μm。图10是#1和#2细胞的Fah基因的Sanger测序图。图11是#1和#2细胞的Rag2基因本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种CRISPR-Cas9特异性敲除猪Fah基因的靶序列，其特征在于，所述序列如SEQ IDNO.17所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种CRISPR-Cas9特异性敲除猪Fah基因的靶序列，其特征在于，所述序列如SEQIDNO.17所示。


2.一种CRISPR-Cas9特异性敲除猪Rag2基因的靶序列，其特征在于，所述序列如SEQIDNO.51所示。


3.权利要求1或2所述靶序列在构建Fah、Rag2双基因敲除的猪细胞中的用途。


4.一种CRISPR-Cas9特异性敲除猪Fah、Rag2双基因的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)合成两种靶序列双链分子，分别连接入CRISPR-sgRNA空表达载体；
(2)使用腺病毒包装带有靶序列的CRISPR-sgRNA表达载体，得重组腺病毒；
(3)将前述重组病毒转入表达Cas9蛋白的猪细胞；
(4)挑取细胞单克隆，鉴定基因敲除效果；
所述靶序列如SEQIDNO.17和51所示。


5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述的连接是粘性末端连...

【专利技术属性】
技术研发人员：包骥，高孟雨，步宏，
申请(专利权)人：四川大学华西医院，
类型：发明
国别省市：四川;51