蜘蛛聚状腺丝蛋白基因序列的应用及其改良家蚕丝性能的方法技术

本发明专利技术公开了一种蜘蛛聚状腺丝蛋白基因序列的应用及其改良家蚕丝性能的方法。蜘蛛聚状腺丝蛋白基因为由络新妇蛛聚状腺丝1倍碱基重复单元以1‑8倍连续重复构成的基因序列，具有改良家蚕丝性能等应用；先构建家蚕合成分泌聚状腺丝蛋白的载体pBac‑ASG质粒，再利用显微注射将质粒与辅助质粒导入到家蚕受精卵内，用转座子使荧光蛋白基因和聚状腺丝蛋白基因导入到家蚕基因组内，并稳定遗传和表达，育成分泌蜘蛛聚状腺丝蛋白的转基因家蚕；本发明专利技术发现了一种蜘蛛聚状腺丝蛋白基因的用途，并开发了一种新型家蚕蜘蛛仿生丝的改良家蚕丝性能的生产方法，降低生产成本，显著提高了蚕丝的机械性能。

【技术实现步骤摘要】
蜘蛛聚状腺丝蛋白基因序列的应用及其改良家蚕丝性能的方法
本专利技术涉及了一种基因的应用及其作用方法，尤其是涉及了一种利用蜘蛛聚状腺丝蛋白基因(ASG)改良家蚕丝性能的方法。
技术介绍
蜘蛛丝是由蜘蛛丝腺分泌形成的蛋白聚合物，是一种多样化的材料家族，具有非凡的力学性能，如高拉伸强度和延展性。在自然界中，蜘蛛需要利用蛛丝来行使各种各样的功能，包括形成保护壳，支撑蛛网结构、繁殖后代和捕捉食物等。后纺亚目蜘蛛，又被称为圆网蜘蛛，这种蜘蛛占现存蜘蛛种类的93.9％，是最多样化的蜘蛛群，拥有七种分化形态的丝腺，包括大壶状腺、小壶状腺、鞭状腺、梨状腺、管状腺、葡状腺、聚状腺，每种丝腺体内可表达一种或多种独特的蛛丝蛋白基因，进而形成具有特定结构的蛛丝纤维或胶状物。聚状腺丝(Aggregatesilkglue)是由聚状腺分泌形成的含有长链糖蛋白的粘性液体，通常覆盖在捕获丝上，提高鞭状丝的韧性，协助捕捉猎物。与其他腺体相比，聚状腺的腺体要大很多，而且成对存在，是所有丝腺中最特殊的一类。研究报道，聚状腺丝素蛋白和其他类型蛛丝蛋白存在很大差异，基因序列中小片段基序(motif)结构多为NVNVN、QPGSG，这两种类型的motif是在其他蛛丝蛋白中未见报道。另有研究表明，当昆虫的表皮蜡质渗透到粘性胶中，可能由于范德华力和毛细管力的影响，猎物和粘性胶之间的粘附力比粘性胶和无蜡表面之间的粘附力强8倍，因此它被认为是最强的生物胶之一，即使在表面能很低的PTFE(聚四氟乙烯)上，也能保持很好的粘性。圆蛛科络新妇属蜘蛛络新妇(Nephilaclavipes)聚状腺丝蛋白(ASG)，由406个氨基酸组成，分子大小约45.2kDa，是目前已完整报道的唯一一类聚状腺丝蛋白。由于蜘蛛具有异嗜行为，无法直接大规模获取天然蜘蛛丝，使得蜘蛛丝的广泛应用受到很大的限制。蚕丝是一种很有前途的生物降解材料，具有抗拉强度高、可生物降解性等特点，随着纺织领域和高新科技对蚕丝需求的增加，其应用层面不断扩大，促使研究人员致力于改变蚕丝纤维的性质，开发一种方便、可靠、具有较高强度和显著延展性的丝纤维材料。相比于在桑叶表面喷涂矿物质、强迫吐丝等费时费力的技术来说，家蚕生活周期短，饲养方便，丝素蛋白产量高，个体小，易饲养，易加工，特别是基于piggyBac的转基因家蚕品系发展越来越成熟，且家蚕吐丝特征与蜘蛛有很大的共通之处，这些优点使其非常有利于作为生物反应器来生产蛛丝蛋白。此外，家蚕饲养在我国有悠久的历史，技术非常深厚，发展和应用家蚕生物反应器生产有价值的蜘蛛丝非常符合我国国情。现有技术中缺少了针对提高蚕丝性能的有效的转基因和处理方法和有效作用基因的发现。
技术实现思路
为了解决
技术介绍
中存在的问题，本专利技术的目的在于利用转基因家蚕技术将蜘蛛聚状腺丝(ASG)基因导入家蚕基因组内，并在家蚕后部丝腺细胞中特异表达，提供一种利用蜘蛛聚状腺丝蛋白基因来改良蚕丝性能的方法，开发出能合成分泌蜘蛛聚状腺丝蛋白的家蚕，通过家蚕丝腺细胞合成的蜘蛛聚状腺丝蛋白分泌到茧层中，直接获得蜘蛛丝-蚕丝新型复合材料，为改良蚕丝力学性能提供新思路。本专利技术发现并将重要应用价值的蛛丝基因导入家蚕基因组，利用丝腺器官具有高效合成蛋白质的能力，育成一批能够高效率大规模生产蛛丝蛋白，进而提高蚕丝的机械性能，并依靠家蚕本身的繁殖续代能力维持家蚕种系，大幅度提升蚕丝经济价值，开创蚕桑生产新局面，具有极大的经济效益和广阔的应用前景。为了达到上述目的，本专利技术采用的技术方案的步骤如下：一、一种蜘蛛聚状腺丝蛋白基因序列的应用：所述蜘蛛聚状腺丝蛋白基因在改良家蚕丝性能、家蚕转基因培养、利用家蚕合成分泌生产蜘蛛丝-蚕丝新型复合材料的应用；所述的蜘蛛聚状腺丝蛋白基因的碱基为由络新妇蛛聚状腺丝1倍碱基重复单元以1-8倍连续重复构成的基因序列。络新妇蛛聚状腺丝(ASG)基因1倍碱基重复单元如SEQIDNO.1，络新妇蛛聚状腺丝1倍碱基重复单元是从完整的络新妇蛛聚状腺丝(ASG)基因碱基序列中局部人工提取获得。所述改良家蚕丝性能是提高蚕丝机械性能。二、一种利用蜘蛛聚状腺丝蛋白基因改良家蚕丝性能的方法：该方法是构建改良家蚕丝力学性能的蜘蛛聚状腺丝蛋白(ASG)基因的表达框，表达框组成包含家蚕丝蛋白信号肽、蜘蛛聚状腺丝蛋白基因和丝蛋白polyA；然后构建带有表达框的质粒，然后将质粒导入到家蚕基因组中经多次培养续代培育成荧光基因和蜘蛛聚状腺丝蛋白基因纯合、丝腺细胞能够合成分泌聚状腺丝蛋白的转基因家蚕，获得能够高效率大规模生产蜘蛛聚状腺丝蛋白的家蚕品种，进而提高蚕丝的机械性能，并依靠家蚕本身的繁殖续代能力维持家蚕种系；所述的蜘蛛聚状腺丝蛋白(ASG)基因采用权利要求1所述的蜘蛛聚状腺丝蛋白(ASG)基因。所述的方法具体如下：(1)采用分子生物学方法构建家蚕合成分泌聚状腺丝蛋白的质粒pBac-ASG，质粒pBac-ASG包含有作为外源基因的聚状腺丝蛋白基因(ASG)和标记基因荧光蛋白的基因；(2)采用显微注射转基因家蚕的方法将pBac-ASG质粒及能够提供piggyBac转座酶的辅助质粒pHA3PIG按浓度比1-2：1的比例导入家蚕产卵后2-8小时内的受精卵中，利用piggyBac转座子将聚状腺丝蛋白插入到家蚕基因组内；(3)蚕卵孵化后再经多次培养续代育成荧光基因和聚状腺丝蛋白基因纯合、丝腺细胞能够合成分泌聚状腺丝蛋白的转基因家蚕；(4)通过家蚕丝腺细胞合成分泌聚状腺丝蛋白，并随家蚕吐丝结茧行为进入蚕茧。由此获得能够高效率大规模生产蜘蛛聚状腺丝蛋白的家蚕品种，进而提高蚕丝的机械性能，并依靠家蚕本身的繁殖续代能力维持家蚕种系。所述的质粒pBac-ASG是以piggyBac转座子为基础并带有Amp抗性基因，质粒pBac-ASG包括piggyBac转座子的两个转座臂pBL和pBR以及两个转座臂PBL和PBR之间的两个功能表达框；一个功能表达框是IE1启动子启动的荧光蛋白基因表达框，另一个功能表达框是包含家蚕丝蛋白基因启动子、家蚕丝蛋白基因信号肽、蜘蛛聚状腺丝蛋白基因和家蚕丝蛋白基因polyA的表达框。所述的辅助质粒pHA3PIG包含Amp抗性基因、piggyBac转座子的一个转座臂pBR、A3启动子启动的piggyBac转座酶的表达框，即A3Promoter-transposase-SV40。所述的蜘蛛聚状腺丝蛋白基因在家蚕丝腺细胞特异表达，在家蚕丝蛋白信号肽的作用下分泌到丝腺腺腔，并经前部丝腺直到蚕茧。所述的荧光蛋白基因包括绿色荧光蛋白基因、红色荧光蛋白基因。所述的家蚕丝蛋白包括丝素蛋白重链、丝素蛋白轻链、丝素蛋白P25基因和和丝胶蛋白1基因。本专利技术是先构建家蚕合成分泌聚状腺丝蛋白的载体pBac-ASG质粒，再利用显微注射将质粒与辅助质粒导入到家蚕受精卵内，用转座子使荧光蛋白基因和聚状腺丝蛋白基因导入到家蚕基因组内，并稳定遗传和表达，育成分泌蜘蛛聚状腺丝素蛋白的转基因家蚕。...

【技术保护点】
1.一种蜘蛛聚状腺丝蛋白基因序列的应用，其特征在于：/n所述蜘蛛聚状腺丝蛋白基因在改良家蚕丝性能、家蚕转基因培养、利用家蚕合成分泌生产蜘蛛丝-蚕丝新型复合材料的应用；所述的蜘蛛聚状腺丝蛋白基因的碱基为由络新妇蛛聚状腺丝1倍碱基重复单元以1-8倍连续重复构成的基因序列。/n

【技术特征摘要】
1.一种蜘蛛聚状腺丝蛋白基因序列的应用，其特征在于：
所述蜘蛛聚状腺丝蛋白基因在改良家蚕丝性能、家蚕转基因培养、利用家蚕合成分泌生产蜘蛛丝-蚕丝新型复合材料的应用；所述的蜘蛛聚状腺丝蛋白基因的碱基为由络新妇蛛聚状腺丝1倍碱基重复单元以1-8倍连续重复构成的基因序列。


2.根据权利要求1所述的一种蜘蛛聚状腺丝蛋白基因序列的应用，其特征在于：所述改良家蚕丝性能是提高蚕丝机械性能。


3.一种利用蜘蛛聚状腺丝蛋白基因改良家蚕丝性能的方法，其特征在于：
该方法是构建改良家蚕丝力学性能的蜘蛛聚状腺丝蛋白(ASG)基因的表达框，表达框组成包含家蚕丝蛋白信号肽、蜘蛛聚状腺丝蛋白基因和丝蛋白polyA；然后构建带有表达框的质粒，然后将质粒导入到家蚕基因组中经多次培养续代培育成荧光基因和蜘蛛聚状腺丝蛋白基因纯合、丝腺细胞能够合成分泌聚状腺丝蛋白的转基因家蚕，获得能够生产蜘蛛聚状腺丝蛋白的家蚕品种，进而提高蚕丝的机械性能，并依靠家蚕本身的繁殖续代能力维持家蚕种系；所述的蜘蛛聚状腺丝蛋白(ASG)基因采用权利要求1所述的蜘蛛聚状腺丝蛋白(ASG)基因。


4.根据权利要求3所述的一种利用蜘蛛聚状腺丝蛋白基因改良家蚕丝性能的方法，其特征在于：所述的方法具体如下：
(1)采用分子生物学方法构建家蚕合成分泌聚状腺丝蛋白的质粒pBac-ASG，质粒pBac-ASG包含有作为外源基因的聚状腺丝蛋白基因(ASG)和标记基因荧光蛋白的基因；
(2)采用显微注射转基因家蚕的方法将pBac-ASG质粒及能够提供piggyBac转座酶的辅助质粒pHA3PIG按浓度比1-2：1的比例导入家蚕产卵后2-8小时内的受精卵中，利用piggyBac转座子将聚状腺丝蛋白插入到家蚕基因组内；
(3)蚕卵孵化后...

【专利技术属性】
技术研发人员：钟伯雄，唐晓利，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33