视紫红质的编码序列、其表达载体构建及其应用制造技术

本发明专利技术提供了视紫红质的编码序列、其表达载体构建及其应用。具体地，本发明专利技术对RHO基因编码序列进行了针对性特殊优化设计，从而获得了一种特别适合在哺乳动物(如人)细胞(如感光细胞、视神经细胞)中高效表达RHO蛋白的核苷酸序列，并构建了一种表达正常人源RHO蛋白的重组AAV病毒。相对于未优化的编码序列，经过特殊优化后的RHO编码序列(SEQ ID NO.:1)的表达量显著提高，非常适合在哺乳动物(尤其是人)细胞内表达，能有效治疗视网膜色素变性。

【技术实现步骤摘要】
视紫红质的编码序列、其表达载体构建及其应用
本专利技术涉及生物制剂领域，尤其涉及视紫红质的编码序列、其表达载体构建及其应用。
技术介绍
视网膜色素变性(retinitispigmentosa,RP)是视网膜感光细胞和色素上皮细胞变性导致进行性视野缺损的一组最常见的遗传性致盲性眼底疾病。患者多表现为夜盲、进行性视野缩小和视力下降，最终因视网膜感光细胞凋亡而导致视功能下降，甚至完全丧失。RP具有高度的遗传异质性和临床异质性,有散发、常染色体显性、常染色体隐性、X连锁遗传和双基因遗传等多种遗传方式。目前此病的发病率为1/3500,全世界至少100万人患有此病，其中中国人约占1/4左右,且发病人数程逐年上升趋势。40％-50％的患者为散发或单发,无家族发病史,称为散发性视网膜色素变性(sporadicretinitispigmentosa,SRP)。X连锁遗传约占所有RP患者的6-20％。常染色体隐性遗传占5％-15％。常染色体显性遗传视网膜色素变性(autosomaldominantretinitispigmentosa，ADRP)占15％～25％。视紫红质(rhodopsin，RHO)基因突变在欧洲及北美占常染色体显性遗传视网膜色素变性(ADRP)的16％-25％,在中国和日本大约7％左右。RHO基因碱基的突变可造成RHO蛋白的氨基酸替换、终止、或缺失而引起RHO蛋白功能异常，从而引起视功能的紊乱。因此，本领域亟需开发一种能够有效治疗视网膜色素变性的基因治疗方法和治疗药物。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种能够有效治疗视网膜色素变性的基因治疗方法和治疗药物。本专利技术的另一目的是提供一种编码视紫红质的编码序列、载体及制备方法。本专利技术的第一方面，提供了一种核苷酸序列，所述核苷酸序列编码视紫红质，且所述核苷酸序列选自下组：(a)所述核苷酸序列如SEQIDNO.:1所示；(b)所述核苷酸序列与SEQIDNO.:1所示的核苷酸序列有≥95％相同性，优选地≥98％，更优选地≥99％；和(c)与(a)或(b)所述的核苷酸序列互补的核苷酸序列。在另一优选例中，所述核苷酸序列包括DNA序列、cDNA序列、或mRNA序列。在另一优选例中，所述核苷酸序列包括单链序列和双链序列。在另一优选例中，所述核苷酸序列包括与SEQIDNO.:1完全互补的核苷酸序列。本专利技术的第二方面，提供了一种融合核酸，所述融合核酸包含如本专利技术第一方面所述的编码视紫红质的核苷酸序列。在另一优选例中，所述融合核酸还包含UTR序列。在另一优选例中，所述UTR序列包括3’UTR和/或5’UTR。在另一优选例中，所述融合核酸从5’端-3’端具有式I结构：Z0-Z1-Z2(I)式中，各“-”独立地为键或核苷酸连接序列；Z0为无、或5’UTR序列；Z1为如本专利技术第一方面所述的核苷酸序列；和Z2为无、或3’UTR序列。在另一优选例中，所述融合核酸从5’-3’端的结构为5’UTR-RHO-3’UTR。在另一优选例中，各个核苷酸连接序列的长度为1-30nt，较佳地1-15nt，更佳地3-6nt。在另一优选例中，所述的核苷酸连接序列来源于限制性内切酶酶切形成的核苷酸接头序列。本专利技术的第三方面，提供了一种载体，所述载体含有如本专利技术第一方面所述的核苷酸序列或本专利技术第二方面所述的融合核酸。在另一优选例中，所述载体包含一个或多个启动子，所述启动子可操作地与所述核酸序列、增强子、转录终止信号、多腺苷酸化序列、复制起点、选择性标记、核酸限制性位点、和/或同源重组位点连接。在另一优选例中，所述的载体选自下组：质粒、病毒载体。在另一优选例中，所述的载体选自下组：慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体(AAV)、或其组合。在另一优选例中，所述载体为病毒颗粒的形式。在另一优选例中，所述载体为腺相关病毒AAV载体。在另一优选例中，所述AAV载体的血清型选自：AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、或其组合。较佳地，所述AAV载体的血清型为AAV8或AAV9。在另一优选例中，所述载体为AAV8载体或AAV9载体。在另一优选例中，所述载体为壳体转移的AAV载体。在另一优选例中，所述载体包含AAV2基因组和AAV8壳体蛋白(AAV2/8)、或AAV2基因组和AAV9壳体蛋白(AAV2/9)。在另一优选例中，所述载体为重组腺相关病毒载体rAAV2/8或rAAV2/9。在另一优选例中，所述的载体包括DNA病毒载体、逆转录病毒载体。在另一优选例中，所述载体为含有或插入有如本专利技术第一方面所述的核苷酸序列或本专利技术第二方面所述的融合核酸的AAV载体；较佳地为rAAV2/8或rAAV2/9载体。在另一优选例中，所述载体的骨架为腺相关病毒载体质粒pSNaV。在另一优选例中，所述载体用于表达视紫红质。本专利技术的第四方面，提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞含有本专利技术第三方面所述的载体，或其染色体中整合有外源的如本专利技术第一方面所述的核苷酸序列或本专利技术第二方面所述的融合核酸。在另一优选例中，所述宿主细胞为哺乳动物细胞，所述哺乳动物包括人和非人哺乳动物。在另一优选例中，所述宿主细胞选自下组：HEK293细胞、感光细胞(包括锥状细胞和/或杆状细胞)、其他视觉细胞(如双节细胞)、(视)神经细胞、或其组合。在另一优选例中，所述宿主细胞选自下组：视杆细胞、视锥细胞、给光双极细胞、撤光双极细胞、水平细胞、神经节细胞、无长突细胞、或其组合。较佳地，所述宿主细胞为(视网膜)神经节细胞或感光细胞。本专利技术的第五方面，提供了如本专利技术第三方面所述的载体的用途，用于制备一制剂或组合物，所述制剂或组合物用于恢复受试者视力、和/或治疗或预防眼部疾病。在另一优选例中，所述眼部疾病为视网膜色素变性(RP)。在另一优选例中，所述制剂或组合物用于治疗或预防视网膜色素变性，如常染色体显性遗传视网膜色素变性(ADRP)。在另一优选例中，所述制剂或组合物用于减少患有或有风险形成视网膜色素变性的受试者中的感光细胞或视神经细胞死亡。本专利技术的第六方面，提供了一种药物制剂，所述的制剂含有(a)本专利技术第三方面所述的载体，以及(b)药学上可接受的载体或赋形剂。在另一优选例中，所述药物制剂的剂型选自下组：冻干制剂、液体制剂、或其组合。在另一优选例中，所述的载体选自下组：慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、或其组合。较佳地，所述载体为AAV载体；更佳地为AAV2/8或AAV2/9载体。在另一优选例中，所述药物制剂中载体的含量为1×109-1×1016个病毒/毫升，较佳地1×1012-1×1013个病毒/毫升。在另一优选例中，所述药物制剂用于治疗或预防眼部疾病，较佳地治疗或预防视网膜色本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列编码视紫红质，且所述核苷酸序列选自下组：/n(a)所述核苷酸序列如SEQ ID NO.:1所示；/n(b)所述核苷酸序列与SEQ ID NO.:1所示的核苷酸序列有≥95％相同性，优选地≥98％，更优选地≥99％；和/n(c)与(a)或(b)所述的核苷酸序列互补的核苷酸序列。/n

【技术特征摘要】
1.一种核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列编码视紫红质，且所述核苷酸序列选自下组：
(a)所述核苷酸序列如SEQIDNO.:1所示；
(b)所述核苷酸序列与SEQIDNO.:1所示的核苷酸序列有≥95％相同性，优选地≥98％，更优选地≥99％；和
(c)与(a)或(b)所述的核苷酸序列互补的核苷酸序列。


2.一种融合核酸，其特征在于，所述融合核酸包含如权利要求1所述的核苷酸序列。


3.如权利要求2所述的融合核酸，其特征在于，所述融合核酸还包含UTR序列，较佳地5’UTR序列和/或3’UTR序列。


4.一种载体，其特征在于，所述载体含有如权利要求1所述的核苷酸序列或权利要求2所述的融合核酸。


5.如权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：李斌，
申请(专利权)人：武汉纽福斯生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42