使用核苷酸靶识别的靶序列特异性改变技术制造技术

提供了用于靶向靶核苷酸序列的方法。该方法包括将以下引入细胞内：（i）CRISPR I‑D型相关蛋白Cas5d、Cas6d和Cas7d，或者编码这些蛋白质的核酸；以及（ii）引导RNA或编码所述引导RNA的DNA，所述引导RNA包括与所述靶核苷酸序列互补的序列、以及在所述互补序列之前和之后的衍生自CRISPR基因座的共同重复序列。

Target sequence specific change technology using nucleotide target recognition

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】使用核苷酸靶识别的靶序列特异性改变技术
本专利技术涉及用于靶向靶核苷酸序列的方法、用于特异性改变靶核苷酸序列的方法和用于抑制靶基因表达的方法，其中利用CRISPR（规律成簇间隔短回文重复）I-D型系统的核苷酸靶识别，以及涉及在所述方法中使用的包含Cas（CRISPR相关）蛋白和引导RNA的复合物。
技术介绍
细菌和古细菌具有CRISPR系统作为针对病毒和异源外源质粒的适应性免疫系统。CRISPR系统使用与入侵的DNA序列互补的低分子RNA（称为引导RNA或gRNA），以促进靶外源DNA的靶向和降解。此时，需要与gRNA结合以形成复合物的Cas蛋白。CRISPR系统包括I型、II型、III型和V型系统。在任何系统中，Cas蛋白-gRNA复合物作用于靶序列，以引起病毒和外源质粒的干扰。在II型和V型系统中，干扰机制涉及通过整合蛋白在靶蛋白上的DNA双链断裂，所述整合蛋白具有保留gRNA结合的蛋白质结构域和RuvC样DNA切割蛋白质结构域。对于III型系统，已在体外和体内证实与II型系统不同，干扰由通过5至8种Cas蛋白和gRNA的复合物切割靶RNA序列引起。近年来，已开发了使用CRISPRII型和V型系统的基因组编辑技术，其中Cas9和Cpf1用作Cas蛋白。Cas9和Cpf1需要在靶序列的附近由约2至5个核苷酸组成的序列，其被称为前间区序列邻近基序（PAM）序列，以便识别靶DNA。已在体外和体内证实，Cas9-gRNA复合物和Cpf1-gRNA复合物是序列特异性RNA引导的核酸内切酶，其在PAM序列附近的靶位点处引起DNA双链断裂。另一方面，关于CRISPRI型系统，已在来自各种细菌的基因组序列中鉴定出多个亚型，并且亚型已命名为I-A、I-B、I-C、I-D、I-E、I-F和I-U型。在这些亚型中，衍生自大肠杆菌（Escherichiacoli）的I-E型系统已得到最多研究，并且已证实由六种Cas蛋白（Cas3、Cse1、Cse2、Cas7、Cas5、Cas6e）和gRNA组成的复合物促进靶DNA序列的降解。然而，对于除了亚型（I-C型）的其它亚型，几乎没有阐明对于干扰效应所需的Cas蛋白组分、gRNA序列、决定靶DNA的PAM序列等。另外，作为使用衍生自CRISPRI型系统的Cas蛋白的技术，已报道了用于抑制靶基因表达的方法，其包括使用编码衍生自CRISPRI型系统的Cas蛋白的重组核酸分子（专利文献1），以及用于改变靶核酸的方法，其包括使用衍生自CRISPRI型系统的Cas蛋白与其它蛋白的复合物（专利文献2和专利文献3）。然而，从未报道通过衍生自CRISPRI型系统的RNA引导的核酸内切酶，用于切割和改变靶DNA分子的双链的技术。引用列表专利文献专利文献1：WO2015/155686专利文献2：JP-A2015-503535专利文献3：WO2017/043573专利技术概述技术问题在常规的CRISPRII型和V型系统中，待用于靶向的RNA分子限于决定靶特异性的约2至5个核苷酸的PAM序列之前或之后的约20个核苷酸的RNA分子。因此，常规的CRISPRII型和V型系统具有以下问题：存在其中不能设计靶的基因座，以及可能切割相似的序列。需要开发不具有该问题的新型靶向系统和新型RNA引导的核酸内切酶。问题的解决方案为了解决上述问题，本专利技术人进行深入研究。结果令人惊讶的是，从CRISPRI-D型中发现了新型靶向系统和新型RNA引导的内切核酸酶，其靶向比基因组编辑技术中常规使用的CRISPRII型或V型RNA引导的内切核酸酶的靶序列更长的序列，然后发现该新型靶向系统和RNA引导的核酸内切酶可以用于基因组编辑技术中，用于允许对靶核苷酸序列的改变。因此，完成了本专利技术。即，本专利技术提供了：[1]一种用于靶向靶核苷酸序列的方法，所述方法包括将以下引入细胞内：（i）CRISPRI-D型相关蛋白Cas5d、Cas6d和Cas7d，或者编码该蛋白质的核酸，和（ii）引导RNA或编码引导RNA的DNA，所述引导RNA包含与靶核苷酸序列互补的序列、以及在互补序列之前和之后的衍生自CRISPR基因座的共同重复序列；[2]一种用于改变靶核苷酸序列的方法，所述方法包括将以下引入细胞内：（i）CRISPRI-D型相关蛋白Cas3d、Cas5d、Cas6d、Cas7d和Cas10d，或者编码该蛋白质的核酸，和（ii）引导RNA或编码引导RNA的DNA，所述引导RNA包含与靶核苷酸序列互补的序列、以及在互补序列之前和之后的衍生自CRISPR基因座的共同重复序列；[3]一种用于抑制靶基因表达的方法，所述方法包括将以下引入细胞内：（i）CRISPRI-D型相关蛋白Cas5d、Cas6d和Cas7d或者编码该蛋白的核酸，和（ii）引导RNA或编码引导RNA的DNA，所述引导RNA包含与靶基因序列的至少一部分互补的序列、以及在互补序列之前和之后的衍生自CRISPR基因座的共同重复序列；[4]根据[1]至[3]中任一项的方法，其中所述引导RNA包含与靶核苷酸序列互补的由20至50个核苷酸组成的序列；[5]根据[2]或[4]的方法，其进一步包括将供体多核苷酸引入细胞内；[6]根据[2]、[4]和[5]中任一项的方法，其中所述改变是核苷酸缺失、插入或取代；[7]根据[1]至[6]中任一项的方法，其中所述Cas5d将5'-GTH-3'（H＝A、C或T）识别为前间区序列邻近基序（PAM）序列；[8]一种复合物，其包含：（i）CRISPRI-D型相关蛋白Cas5d、Cas6d和Cas7d，和（ii）引导RNA，其包含与靶核苷酸序列互补的序列、以及在互补序列之前和之后的衍生自CRISPR基因座的共同重复序列；[9]根据[8]的复合物，其进一步包含Cas3d和Cas10d；[10]根据[8]或[9]的复合物，其中所述引导RNA包含与靶核苷酸序列互补的由20至50个核苷酸组成的序列；[11]一种表达载体，其包含：（i）编码CRISPRI-D型相关蛋白Cas5d、Cas6d和Cas7d的核酸，和（ii）编码引导RNA的DNA，所述引导RNA包含与靶核苷酸序列互补的序列、以及在互补序列之前和之后的衍生自CRISPR基因座的共同重复序列；[12]根据[11]的表达载体，其进一步包含编码Cas3d和Cas10d的核酸；[13]一种DNA分子，其编码根据[8]至[10]中任一项的复合物；[14]以下用于靶向靶核苷酸序列的用途（i）CRISPRI-D型相关蛋白Cas5d、Cas6d和Cas7d，或者编码该蛋白质的核酸，和（ii）引导RNA或编码引导RNA的DNA，所述引导RNA包含与靶核苷酸序列互补的序列、以及在互补序列之前和之后的衍生自CRISPR基因座的共同重复序列；[15]以下用于改变靶核苷酸序列的用途本文档来自技高网...

【技术保护点】
1. 一种用于靶向靶核苷酸序列的方法，所述方法包括将以下引入细胞内：/n（i）CRISPR I-D型相关蛋白Cas5d、Cas6d和Cas7d，或者编码该蛋白质的核酸，和/n（ii）引导RNA或编码引导RNA的DNA，所述引导RNA包含与靶核苷酸序列互补的序列、以及在互补序列之前和之后的衍生自CRISPR基因座的共同重复序列。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170821 JP 2017-158876;20171208 JP 2017-2365181.一种用于靶向靶核苷酸序列的方法，所述方法包括将以下引入细胞内：
（i）CRISPRI-D型相关蛋白Cas5d、Cas6d和Cas7d，或者编码该蛋白质的核酸，和
（ii）引导RNA或编码引导RNA的DNA，所述引导RNA包含与靶核苷酸序列互补的序列、以及在互补序列之前和之后的衍生自CRISPR基因座的共同重复序列。


2.一种用于改变靶核苷酸序列的方法，所述方法包括将以下引入细胞内：
（i）CRISPRI-D型相关蛋白Cas3d、Cas5d、Cas6d、Cas7d和Cas10d，或者编码该蛋白质的核酸，和
（ii）引导RNA或编码引导RNA的DNA，所述引导RNA包含与靶核苷酸序列互补的序列、以及在互补序列之前和之后的衍生自CRISPR基因座的共同重复序列。


3.一种用于抑制靶基因表达的方法，所述方法包括将以下引入细胞内：
（i）CRISPRI-D型相关蛋白Cas5d、Cas6d和Cas7d或者编码该蛋白的核酸，和
（ii）引导RNA或编码引导RNA的DNA，所述引导RNA包含与靶基因序列的至少一部分互补的序列、以及在互补序列之前和之后的衍生自CRISPR基因座的共同重复序列。


4.根据权利要求1至3中任一项的方法，其中所述引导RNA包含与靶核苷酸序...

【专利技术属性】
技术研发人员：刑部敬史，刑部祐里子，
申请(专利权)人：国立大学法人德岛大学，
类型：发明
国别省市：日本;JP