经修饰的神经氨酸酶制造技术

本发明专利技术提供了修饰型神经氨酸酶、编码所述修饰型神经氨酸酶的基因、所述修饰型神经氨酸酶和组织蛋白酶A的组合、编码所述修饰型神经氨酸酶的基因和编码组织蛋白酶A的基因的组合、包含所述基因的载体，以及包含前述任一项的药物组合物。该药物组合物可用于溶酶体贮积病的疗法。病的疗法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】经修饰的神经氨酸酶


[0001]相关申请本申请要求于2019年7月5日向日本专利局提交的日本申请号2019
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126376的优先权权益，所述申请通过引用整体并入本文。
[0002]本专利技术涉及经修饰的神经氨酸酶和编码所述经修饰的神经氨酸酶的基因。本专利技术还涉及经修饰的神经氨酸酶和组织蛋白酶A的组合、编码经修饰的神经氨酸酶的基因和编码组织蛋白酶A的基因的组合。本专利技术还涉及含有任何这些基因的载体。本专利技术还涉及含有前述任一项的药物组合物。

技术介绍

[0003]神经氨酸酶(N
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乙酰基
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α
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神经氨酸酶，也称为溶酶体唾液酸酶)是一类通过水解除去糖链的末端唾液酸残基的糖苷酶。已知人细胞中存在四种类型的神经氨酸酶。其中，神经氨酸酶1(在下文中，也称为NEU1)已被积极研究作为两种临床上类似的神经退行性溶酶体贮积病(即唾液酸贮积症和半乳糖唾液酸贮积症)的靶酶。此外，专利文献1描述了NEU1的缺乏也与淀粉样变性相关，而非专利文献1描述了NEU1也与癌症转移和浸润相关。
[0004]溶酶体贮积病(也称为溶酶体病)是一组基于编码酸性水解酶(溶酶体酶)或包含在溶酶体中的辅因子的基因的突变的先天性代谢错误的疾病，其中溶酶体是在细胞内外分解和代谢生物分子的细胞内小器官(细胞器)。溶酶体贮积病是一种不可治愈的疾病。然而，在1990年之后，酶替代疗法(ERT)已经投入实际应用，并在临床上应用于主要具有外周症状的九类患者(非专利文献2)。酶替代疗法是将从导入了正常人溶酶体酶基因的培养动物或植物细胞株分泌并纯化的重组酶制剂定期(每1
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2周)连续静脉内施用给患者的方法。然而，酶替代疗法具有适用疾病有限的问题。因此，需要治疗溶酶体贮积病的另一种方法。
[0005]现有技术文献专利文献专利文献1: JP 2014
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526904 A非专利文献非专利文献1: Journal of Japanese Biochemical Society, Vol. 80, No. 1, 13
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23, 2008非专利文献2: Journal of Pharmaceutical Society of Japan, Vol.138, No.7 (2018)。

技术实现思路

[0006]专利技术要解决的问题本专利技术人已对使用人神经氨酸酶1的基因疗法进行了研究，并且已发现人神经氨酸酶1的过表达引起胞内结晶，导致细胞破裂。因此，已发现将人神经氨酸酶1应用于基因疗法会损害细胞并涉及风险。本专利技术的一个目的是提供经修饰的神经氨酸酶，其在细胞中不
结晶并且可用于基因疗法。本专利技术的另一个目的是提供将神经氨酸酶1与溶酶体共定位的方法。
[0007]本专利技术人为解决上述问题已进行了广泛研究，并已发现某些经修饰的神经氨酸酶1即使在细胞中过表达时也不结晶。还发现当组织蛋白酶A (CTSA)过表达时，神经氨酸酶1与溶酶体共定位。基于上述发现完成了本专利技术。
[0008]具体地说，本专利技术涉及：(1) 经修饰的神经氨酸酶，其包含与SEQ ID NO: 1中所示氨基酸序列具有80％序列同一性的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列相对于SEQ ID NO: 1中所示氨基酸序列具有以下突变：(i) W173N或K175S突变；和(ii) K358N突变；(2) 经修饰的神经氨酸酶，其具有SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 3所示的序列；(3) 核酸，其编码(1)或(2)的经修饰的神经氨酸酶；(4) 载体，其包含(3)的核酸；(5) (4)的载体，其为AAV载体；(6) (4)或(5)的载体，其进一步包含编码组织蛋白酶A的核酸；(7) 药物组合物，其包含(1)或(2)的经修饰的神经氨酸酶或(4)至(6)中任一项的载体；以及(8) (7)的药物组合物，其用于治疗与神经氨酸酶1活性缺失或减弱相关的疾病。
[0009]本专利技术能够提供经修饰的神经氨酸酶1，其即使在过表达时也不结晶或仅轻微结晶。神经氨酸酶1与组织蛋白酶A的组合使用能够使神经氨酸酶1与溶酶体共定位。
附图说明
[0010]图1是展示表达NEU1变体的质粒的实例的示意图。
[0011]图2是展示NEU1变体1和2与野生型NEU1相比的神经氨酸酶活性的示意图。
[0012]图3是展示当野生型NEU1过表达时免疫染色结果的示意图。A：NEU1，B：溶酶体，C：A和B的叠加图像。细胞核用Hoechst 33258染色，NEU1用抗NEU1染色，而溶酶体用Lysotracker染色。
[0013]图4是展示NEU1变体1过表达时免疫染色结果的示意图。A：NEU1，B：溶酶体，C：A和B的叠加图像。细胞核用Hoechst 33258染色，NEU1用抗NEU1染色，而溶酶体用Lysotracker染色。
[0014]图5是展示用于制备CTSA过表达细胞的质粒的示意图。
[0015]图6是展示当NEU1变体1在CTSA过表达细胞中过表达时免疫染色结果的示意图。A：NEU1，B：溶酶体，C：A和B的叠加图像。细胞核用Hoechst 33258染色，NEU1用抗NEU1染色，而溶酶体用Lysotracker染色。
[0016]图7是展示CTSA + NEU1变体共表达质粒的实例的示意图。
[0017]图8展示了用作阴性对照的表达EGFP的质粒。
[0018]图9展示将每种质粒引入敲除NEU1的HEK293细胞时的神经氨酸酶活性。
[0019]图10展示将每种质粒引入敲除NEU1的HEK293细胞时的羧肽酶活性。
[0020]图11展示将每种质粒引入敲除CTSA的HEK293细胞时的神经氨酸酶活性。
[0021]图12展示将每种质粒引入敲除CTSA的HEK293细胞时的羧肽酶活性。
[0022]图13是展示制备CTSA + NEU1变体共表达AAV载体的程序的示意图。
[0023]图14是展示制备CTSA + NEU1变体共表达AAV载体的程序的示意图。
[0024]图15展示用于扩增CTSA + NEU1变体共表达AAV载体的载体。
[0025]图16是展示向各种HEK293细胞施用EGFP表达载体(阴性对照)和CTSA + NEU1变体共表达AAV载体时神经氨酸酶活性的示意图。
[0026]图17是展示向各种HEK293细胞施用EGFP表达载体(阴性对照)和CTSA + NEU1变体共表达AAV载体时的羧肽酶活性的示意图。
[0027]图18是展示健康人皮肤成纤维细胞的神经氨酸酶活性，和当向源自半乳糖唾液酸贮积症患者的皮肤成纤维细胞施用EGFP表达载体(阴性对照)或CTSA + NEU1变体共表达AAV载体时的神经氨酸酶活性的示意图。
[0028]图19是展示健康人皮肤成纤维细胞的神经氨酸酶活性，和当向源自唾液酸沉积症患者的皮肤成纤维细胞施用EGFP表达载体(本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1. 经修饰的神经氨酸酶，其包含与SEQ ID NO: 1中所示氨基酸序列具有80％序列同一性的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列相对于SEQ ID NO: 1中所示氨基酸序列具有以下突变：(i) W173N和K175S突变；和(ii) K358N突变。2. 经修饰的神经氨酸酶，其具有SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 3中所示序列。3.核酸，其编码根据权利要求1或2所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：伊藤孝司，月本准，
申请(专利权)人：国立大学法人德岛大学，
类型：发明
国别省市：