生产尿嘧啶糖基化酶的方法及用于该方法的双载体系统技术方案

本发明专利技术涉及生物技术领域，更具体地，本发明专利技术涉及一种生产尿嘧啶糖基化酶(UDG)的方法及用于该方法的双载体系统。该方法可以显著提高了UDG的溶解性，从而增加UDG的表达量和产量，同时保证了UDG的活性、稳定性和纯度。稳定性和纯度。稳定性和纯度。

【技术实现步骤摘要】
生产尿嘧啶糖基化酶的方法及用于该方法的双载体系统


[0001]本专利技术的涉及生物
，更具体地，本专利技术涉及一种生产尿嘧啶糖基化酶的方法及用于该方法的双载体系统。

技术介绍

[0002]尿嘧啶糖基化酶(UDG)是一种特异性降解含尿嘧啶碱基DNA的水解酶，主要用于PCR残留污染的控制。依据UDG蛋白的热稳定性分为耐热型UDG和热敏型UDG(不耐热)。耐热型UDG由于热稳定好，使用过程中很难彻底被热灭活，因此会影响下游检测技术(如qPCR、多重PCR、体外诊断试剂盒等)的灵敏度。因此，热敏型UDG更加适合兼容到qPCR等高灵敏度检测技术中。
[0003]目前热敏UDG主要起源于嗜冷海洋生物，如大西洋鳕鱼和南极细菌，来源于这些海洋生物的UDG的耐热性能差，其在表达过程中易形成包涵体而导致溶解度较低，而在纯化过程中易降低活性和丢失活性，最终导致UDG的产量较低。因此，UDG基因的挖掘、表达载体的构建方式、表达和纯化工艺都是开发该酶的技术难点。
[0004]因此，本领域亟需一种UDG的生产方法，该方法可以显著提高UDG的溶解性，增加UDG的表达量和产量，同时保证UDG的活性、稳定性和纯度。

技术实现思路

[0005]如上所述，现有的UDG生产方法，由于UDG在表达过程中溶解度较低，而在纯化过程中又易活性降低和活性丢失，最终导致UDG的产量较低。因此，本领域亟需一种UDG的生产方法，该方法可以显著提高了UDG的溶解性，从而增加UDG的表达量和产量，同时保证UDG的活性、稳定性和纯度。/>[0006]有鉴于此，在第一方面，本专利技术提供了一种生产尿嘧啶糖基化酶(UDG)的方法，所述方法包括以下步骤：
[0007]a)提供一种表达细胞，所述表达细胞包含能够表达所述UDG的第一载体和能够表达分子伴侣素系统GroEL
‑
GroES的第二载体，其中，所述UDG的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，并且所述GroEL和GroES的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示；
[0008]b)在第一诱导条件下诱导所述表达细胞表达所述分子伴侣素系统GroEL
‑
GroES；
[0009]c)在第二诱导条件下诱导所述表达细胞同时表达所述分子伴侣素系统GroEL
‑
GroES和所述UDG。
[0010]在第二方面，本专利技术提供了一种双载体系统，所述双载体系统包含：
[0011](1)第一载体，所述第一载体能够表达尿嘧啶糖基化酶(UDG)，所述UDG的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；以及
[0012](2)第二载体，所述第二载体能够表达分子伴侣素系统GroEL
‑
GroES，所述GroEL和GroES的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示。
[0013]在第三方面，本专利技术提供了一种表达细胞，所述表达细胞包含本专利技术第二方面的
双载体系统。
[0014]在第四方面，本专利技术提供了一种试剂盒，所述试剂盒包含：本专利技术第三方面的表达细胞、以及用于指导如何利用该试剂盒来生产尿嘧啶糖基化酶(UDG)的说明书。
[0015]本专利技术的有益效果包括以下一个或者多个：
[0016]1)提供了一种生产尿嘧啶糖基化酶(UDG)的方法，该方法可以显著提高UDG的溶解性，从而增加UDG的表达量和产量；
[0017]2)提供了一种可用于生产易受温度影响的热敏型UDG的方法，通过低温诱导和低温纯化保证了热敏型UDG的活性和稳定性；
附图说明
[0018]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的实施方案。
[0019]图1显示了以嗜冷菌UDG与常用的UDG为对象构建的进化树。
[0020]图2显示了在37℃、0.5mM IPTG、220rpm的诱导条件下，包含单质粒系统的大肠杆菌中UDG(U1
‑
U8)表达的凝胶电泳结果图。诱导前：未加入诱导剂的破碎细胞；全细胞：加入诱导剂后的破碎细胞；上清：全细胞的上清样品；虚线为UDG蛋白。
[0021]图3显示了在不同的温度和诱导剂浓度的诱导条件下，包含单质粒系统的大肠杆菌中UDG(U1
‑
U8)表达的凝胶电泳结果图。诱导前：未加入诱导剂的破碎细胞；全细胞：加入诱导剂后的破碎细胞；上清：全细胞的上清样品；虚线为UDG蛋白。
[0022]图4显示了在相同的诱导条件下，包含双质粒系统的大肠杆菌通过同时诱导和分步诱导表达的UDG(U3和U4)的凝胶电泳结果图。
[0023]图5进一步显示了在相同的诱导条件下，包含单质粒系统或双质粒系统的大肠杆菌通过同时诱导和分步诱导表达的U3的凝胶电泳结果图。
[0024]图6显示了双质粒系统中通过同时诱导(A)和分步诱导(B)表达的U3在经过亲和层析后的凝胶电泳结果图。
具体实施方式
[0025]为更好地说明本专利技术的目的、技术方案和优点，下面将结合本专利技术的实施方案和附图，对本专利技术进行清楚、完整的描述。显然，所描述的实施方案仅仅是本专利技术的一部分实施方案，而不是全部的实施方案。基于本专利技术中的实施方案，本领域普通技术人员可以获得的所有其他实施方案，都属于本专利技术保护的范围。
[0026]如上所述，现有的UDG生产方法，由于UDG在表达过程中溶解度较低，而在纯化过程中又易活性降低和活性丢失，最终导致UDG的产量较低。因此，本专利技术的目的在于提供一种新的UDG的生产方法，该方法能够提高UDG的溶解性，从而增加UDG的表达量和产量，同时保证UDG的活性、稳定性和纯度。
[0027]“分子伴侣(chaperone)”是一类协助细胞内分子组装和协助蛋白质折叠的蛋白质，分子伴侣主要有三大类：伴侣蛋白(chaperonin)、热激蛋白70家族和热激蛋白90家族。
GroEL及其辅助蛋白GroES(GroEL
‑
GroES)是大肠杆菌中的一类典型伴侣蛋白，GroEL
‑
GroES一起在ATP作用下形成桶状复合体，为蛋白质折叠提供合适的微环境。本专利技术人在实验过程中意外发现：GroEL
‑
GroES也能够用于促进UDG的折叠。因此，本专利技术人设想是否能够通过GroEL
‑
GroES来提高UDG的溶解性，从而提高UDG的产量。
[0028]专利技术人经试验发现：如果把表达UDG和GroEL
‑
GroES的基因序列构建在同一个载体中并用该载体转化宿主细胞，则无法对由此得到的转化细胞进行分步诱导。如果将表达UDG和GroEL
‑
GroES的基因序列分别构建在两个载体中(双载体系统)，再用本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种生产尿嘧啶糖基化酶(UDG)的方法，所述方法包括以下步骤：a)提供一种表达细胞，所述表达细胞包含能够表达所述UDG的第一载体和能够表达分子伴侣素系统GroEL
‑
GroES的第二载体，其中，所述UDG的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，并且所述GroEL和GroES的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示；b)在第一诱导条件下诱导所述表达细胞表达所述分子伴侣素系统GroEL
‑
GroES；c)在第二诱导条件下诱导所述表达细胞同时表达所述分子伴侣素系统GroEL
‑
GroES和所述UDG。2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述第一诱导条件为使用第一诱导剂(例如阿拉伯糖)于16℃至37℃诱导5小时至0.5小时，优选于25℃诱导3小时，以诱导所述表达细胞表达所述分子伴侣素系统GroEL
‑
GroES；所述第二诱导条件为使用所述第二诱导剂(例如阿拉伯糖)和第三诱导剂(例如异丙基
‑
β
‑
D
‑
硫代半乳糖苷(IPTG))于16℃至20℃、优选于16℃诱导16小时至20小时，以诱导所述表达细胞同时表达所述分子伴侣素系统GroEL
‑
GroES和所述UDG，其中所述第二诱导剂诱导所述表达细胞表达所述分子伴侣素系统GroEL
‑
GroES，所述第三诱导剂诱导所述表达细胞表达所述UDG。3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述第一诱导剂和所述第二诱导剂的浓度各自独立地为0.001％至1.0％，优选为0.4％；所述第三诱导剂的终浓度为0.1mM至1.0mM，优选为0.1mM。4.根据权利要求1
‑
3任一项所述的方法，其中，在步骤a)中，所述表达细胞是通过分别用所述第一载体和第二载体转化同一宿主细胞获得的；优选地，所述第一载体和所述第二载体是通过不同转化方法来转化所述宿主细胞的，所述转化方法为例如热激法和/或电击法；更优选地，所述第一载体是通过热激法来转化所述宿主细胞的，所述第二载体是通过电击法来转化所述宿主细胞的。优选地，所述第一载体和所述第二载体为质粒；更优选地，所述第一载体为表达所述UDG的质粒，例如pET21a、pHUE、pET20b、pET
‑

【专利技术属性】
技术研发人员：杜军，宋辉，曹文刚，肖晓文，
申请(专利权)人：湖北擎科生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：