一种环麦芽糊精酶及其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种环麦芽糊精酶及其制备方法与应用。所述的酶序列见SEQ ID NO：2。本发明专利技术基于喜热厌氧菌基因组测序数据分析获得环麦芽糊精酶CtCD基因序列，并对CtCD基因序列进行优化，通过人工合成的方法获得优化后的环麦芽糊精酶基因序列，并添加酶切位点SacI和XhoI，将该优化后的基因克隆入pET28a

【技术实现步骤摘要】
一种环麦芽糊精酶及其制备方法与应用


[0001]本专利技术涉及采用基因工程手段获得一种环麦芽糊精酶及其制备方法与应用，属于生物工程


技术介绍

[0002]环糊精是由淀粉或淀粉衍生物产生的一组具有六个或更多吡喃葡萄糖单元通过α
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1,4糖苷键连接的环状低聚糖。环糊精分子呈截锥状结构，其亲水基团位于结构外表面，而疏水基团位于结构内部空腔。因环糊精结构特殊，其可溶于水，并能同时容纳亲脂性客体分子，被广泛应用于食品、农业、化妆品、制药等领域。由于环糊精在食品、医药等多个行业的大量使用，人们对其使用安全性进行了不少研究。根据环糊精的药代动力学研究，发现口服环糊精的生物利用度较低，高剂量的α
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环糊精和β
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环糊精可能具有肾毒性和肝毒性，因此环糊精的代谢越来越引起了人们的关注。
[0003]环麦芽糊精酶属于糖苷水解酶GH13家族的成员，它对环糊精水解能力最强，也能够水解普鲁兰糖和淀粉，而传统的α
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淀粉酶几乎不能水解环糊精和普鲁兰糖。环麦芽糊精酶在初始阶段先断裂环糊精的α
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1,4糖苷键，将环糊精开环生成单一麦芽低聚糖，再将麦芽低聚糖彻底水解为麦芽糖和葡萄糖。利用环麦芽糊精酶的水解特性，可用于制备单一或混合聚合度的低聚麦芽糖。低聚麦芽糖由于其水溶性好、易消化、保湿等优良特性被广泛应用于食品、医药和化妆品等行业。近来研究发现，基于细菌特异性的麦芽糊精转运途径，利用麦芽六糖修饰的胆固醇和细菌响应脂质成分开发的智能纳米脂质体平台可以特异性地靶向检测细菌感染部位。此外，研究还发现麦芽糖淀粉酶(可降解β
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环糊精)/β
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环糊精介导的药物控释系统在低水溶性药物或疏水性化合物的控释方面具有潜在的应用前景。
[0004]与传统淀粉酶相比，环麦芽糊精酶研究较少。目前报道的环麦芽糊精酶主要来源于芽孢杆菌属、梭菌属、类芽孢杆菌属、厌氧芽孢杆菌属、脂环酸芽孢杆菌属和热球菌属的成员，这些环麦芽糊精酶大部分仅能水解一种或两种环糊精，极少能够对三种环糊精(α
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环糊精、β
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环糊精和γ
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环糊精)均有很强的水解作用。此外，目前已鉴定的环麦芽糊精酶多用于麦芽寡糖制备，且其底物特异性和热稳定性较差。开发高活力、底物特异性强和热稳定性好的新型环麦芽糊精酶应用前景广阔。

技术实现思路

[0005]本专利技术的主要目的是针对现有技术的不足，提供一种环麦芽糊精酶(命名为CtCD)。
[0006]该酶的最适温度为60℃，最适pH为6.5；该酶在55℃和60℃条件下非常稳定，在55℃保温32h和60℃保温28h，其酶活力均无下降，在65℃保温3h其酶活力也没有明显变化；该酶对三种环糊精(α
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环糊精、β
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环糊精和γ
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环糊精)均有很强的水解作用，在初始阶段先将三种环糊精开环，最终将三种环糊精完全水解为麦芽糖和葡萄糖。
[0007]本专利技术的另一目的，在于提供一种环麦芽糊精酶的制备方法与应用，它包括如下
步骤：
[0008](1)环麦芽糊精酶基因的设计及获得
[0009]基于喜热厌氧菌(Caloranaerobacter sp.MCCC 1A00790)基因组测序数据分析获得环麦芽糊精酶CtCD基因序列，并对所述基因序列进行优化，使其适合在大肠杆菌中进行表达，通过人工合成的方法获得优化后的环麦芽糊精酶CtCD基因序列，并添加酶切位点SacI和XhoI。
[0010](2)重组质粒的构建
[0011]人工合成的带有SacI和XhoI酶切位点的环麦芽糊精酶基因的DNA片段经限制性内切酶SacI和XhoI酶切后，被连接到经同样限制性内切酶酶切的表达载体pET28a
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SUMO上，将连接产物转化大肠杆菌Escherichia coli TOP10受体菌株，筛选含有环麦芽糊精酶基因的重组质粒，并进行双酶切和测序验证。
[0012](3)环麦芽糊精酶的表达与纯化
[0013]将含有环麦芽糊精酶基因的重组质粒转化入大肠杆菌E.coli Rosette受体菌株，用IPTG诱导环麦芽糊精酶蛋白表达，采用Ni
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Sepharose亲和层析(Ni Sepharose
TM
6Fast Flow试剂盒)纯化重组蛋白。纯化后的重组环麦芽糊精酶(rCtCD)的SDS
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PAGE电泳检测结果如图1所示。
[0014]本专利技术的环麦芽糊精酶具有良好的热稳定性，对三种环糊精均有很强的水解作用，利用其初始阶段对环糊精的开环反应，在制备单一麦芽寡糖(麦芽六糖、麦芽七糖或麦芽八糖)方面具有应用潜力；此外，该酶明显抑制致病菌金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的生物膜形成，可用于和抗生素联用治疗生物膜引起的耐药性致病菌感染。
附图说明
[0015]图1为纯化后的酶蛋白的SDS
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PAGE电泳；
[0016]图2为不同pH对酶活力的影响；
[0017]图3为不同温度对酶活力的影响；
[0018]图4为酶在不同温度条件下的稳定性检测；
[0019]图5为酶对不同底物水解作用的效果；
[0020]图6为酶的完全水解产物分析；
[0021]图7为酶的开环反应水解产物分析；
[0022]图8为酶对金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的生物膜形成的影响
具体实施方式
[0023]实施例1环麦芽糊精酶的制备
[0024]步骤如下：
[0025]实验材料
[0026]喜热厌氧菌(Caloranaerobacter sp.MCCC 1A00790)(中国海洋微生物菌种保藏管理中心保藏，保藏编号为1A00790，可通过购买方式得到)，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus ATCC 6538)和铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa ATCC 10145)(购自美国菌种保藏中心)，大肠杆菌E.coil TOP10、大肠杆菌E.coil Rosetta(购自
ThermoFisher公司)、表达载体pET28a
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SUMO(购自Novagen公司)；限制性内切酶SacI和XhoI(购自全式金公司)；T4连接酶(购自Takara公司)；LB培养基(每升含1％蛋白胨，0.5％酵母抽提物，1％NaCl)；TSB培养基(每升含1.7％胰酪蛋白胨，0.3％大豆蛋白胨，0.25％葡萄糖，0.5％NaCl，0.25％K2HPO4)；THB培养基(每升含2％细菌蛋白胨，0.31％牛心浸粉，0.2％葡萄糖，0.25％Na2CO3，0.2％NaCl，0.04％Na2HPO4)；结合缓冲液(磷酸盐缓冲液：20mM磷酸盐，pH7.2～7.4)；漂洗缓冲液(500mM NaCl,10～50mM咪唑，20mM磷本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种表达环麦芽糊精酶的基因序列，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。2.一种重组载体，其含有权利要求1所述的一种表达环麦芽糊精酶的基因序列。3.一种重组菌，其含有权利要求2所述的重组载体。4.一种环麦芽糊精酶，其特征在于：其蛋白序列如SEQ ID NO:2所示。5.如权利要求4所述的环麦芽糊精酶在麦芽寡糖制备中的应用。6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的环麦芽糊精酶将α
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环糊精、β
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环糊精和γ
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环糊精中的至少一种水解为麦芽寡糖。7.如权利要求4所述的环麦芽糊精酶在制备抗耐药性致病菌药物中的应用。8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的耐药性致病菌包括金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌中的至少一种。9.重组菌突变体，其特征在于：其外源序列编码的蛋白序列与权利要求4所述的蛋白序列的相似性大于95％。1...

【专利技术属性】
技术研发人员：邵宗泽，周梅先，闫康路，董彬彬，
申请(专利权)人：自然资源部第三海洋研究所，
类型：发明
国别省市：