【技术实现步骤摘要】
本申请涉及生物，特别涉及一种pcr预混液及pcr扩增方法。
技术介绍
1、实时荧光定量pcr(quantitative real time pcr，rt-qpcr)技术现如今已被广泛应用于组织、细胞、病毒、病原菌检测、转基因食品检测、癌症基因检测等领域。一般在对样本进行基因检测时，首先需要rna提取试剂盒对样本进行rna提取，再经过逆转录试剂盒将rna逆转录成第一链cdna，最后利用qpcr mix(qpcr预混液)将cdna进行real time pcr扩增反应。这一系列流程需要经过复杂的操作步骤和将近7-8小时的实验操作时间，在此过程中任何一个环节的试剂盒性能不佳或者操作者操作稍有不当都会导致失败，极大的浪费人力、物力、时间成本。
2、随着生物技术的发展，直扩rt-qpcr技术在一定程度上简化了核酸提取、逆转录反应步骤，减少了实验时间。现有技术的直扩rt-qpcr试剂盒需要先将样本用2-3管裂解反应液和终止液在较高的温度下反应才能获得裂解产物，然后离心去沉淀，再将释放出来的核酸上清液进行dnase i酶消化获得rna，最后用一步法rt-qpcr mix(rt-qpcr预混液)进行基因扩增反应。整个流程虽然是直扩类试剂盒，省去了离心柱法rna核酸提取和逆转录反应流程，操作流程上仍较为复杂，需耗时2小时，且试剂盒涉及较多的专业设备和洁净环境，对人员也有特殊要求。同时整个流程需要用到蛋白变构剂、强碱、有机溶剂和/或高浓度盐离子，这些都会导致扩增结果准确度低。目前，市场上多为动物、植物类直扩pcr试剂盒，口腔拭子、鼻咽部
3、目前，细胞慢病毒滴度测定的方法主要采用荧光滴度法、elisa法和rt-qpcr法。操作复杂、反复开盖、耗时长、准确度低和试剂成本高是目前慢病毒滴度测定上的主要缺陷，特别是在细胞数量少的情况下，繁琐的步骤和反复开盖使核酸损耗严重、易受核酸气溶胶污染，导致无法准确检测慢病毒滴度水平。至今，仍没有发现一种简便、快速、高效的慢病毒滴度鉴定方法。
技术实现思路
1、基于此，本申请有必要提供一种pcr预混液，使用该pcr预混液进行pcr扩增时，可以将样本直接加入pcr预混液中进行pcr扩增，省去了核酸提取或样本裂解、去基因组和逆转录反应等复杂的操作步骤，在pcr预混液中即可进行样本rna的释放、完成去基因组反应、逆转录反应和qpcr扩增反应。同时该pcr预混液能够快速简便、准确测定细胞慢病毒滴度水平。
2、具体技术方案如下：
3、一种pcr预混液，所述pcr预混液包括聚乙二醇辛基苯基醚、辛基苯基-聚乙烯二醇、bsa和蓝色葡聚糖2000。
4、在其中一个实施例中，所述pcr预混液包括以下工作浓度的组分：0.01％v/v～0.1％v/v聚乙二醇辛基苯基醚、0.05％v/v～0.5％v/v辛基苯基-聚乙烯二醇、0.05％w/v～0.5％w/v bsa和0.005％w/v～0.05％w/v蓝色葡聚糖2000。
5、一种pcr扩增方法，所述pcr扩增方法包括使用所述pcr预混液或使用所述的试剂或试剂盒进行扩增。
6、在其中一个实施例中，扩增的样本包括细胞样本。
7、所述pcr预混液和所述试剂或试剂盒用于慢病毒滴度测定。
8、相对于传统技术，本申请具备如下有益效果：
9、本申请提供了包含聚乙二醇辛基苯基醚、辛基苯基-聚乙烯二醇、bsa和蓝色葡聚糖2000的pcr预混液，是将聚乙二醇辛基苯基醚、辛基苯基-聚乙烯二醇、bsa和蓝色葡聚糖2000组分复配，协同促使未经处理样本的细胞高效裂解，对释放的rna和热启动tth酶同时具有保护作用，显著提高pcr扩增效果。此外，pcr预混液配方成分温和、无毒，提高人员操作安全性。
10、利用该pcr预混液进行扩增时，无需对样本进行核酸提取或裂解、去基因组和逆转录反应等复杂的前处理操作，可以直接在样本加入上述pcr预混液进行扩增反应，在同一个pcr反应管中使核酸提取、去基因组、反转录、qpcr各反应连续进行，无需反复开盖及复杂操作，大大提高操作简便性，减少反应时间，避免操作过程引起的核酸污染，提高检测效率及准确度。在操作过程中，无需涉及水浴锅、pcr仪等实验室专业设备和特殊环境，且pcr预混液组分少、成本低，具有较高的经济效益。
11、本申请提供的pcr预混液及pcr方法对低细胞数量的样本仍具有较高的检测灵敏度。该方法可快速、高效、准确测定细胞慢病毒滴度水平。
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1.一种PCR预混液，其特征在于，所述PCR预混液包括聚乙二醇辛基苯基醚、辛基苯基-聚乙烯二醇、BSA和蓝色葡聚糖2000。
2.根据权利要求1所述的PCR预混液，其特征在于，所述PCR预混液包括以下工作浓度的组分：
3.根据权利要求1所述的PCR预混液，其特征在于，所述PCR预混液还包括适配体；
4.根据权利要求3所述的PCR预混液，其特征在于，所述适配体在所述PCR预混液中的工作浓度为0.05μM～1μM。
5.根据权利要求1～4任一项所述的PCR预混液，其特征在于，所述PCR预混液还包括酶、缓冲基质、dNTPs、阳离子、RNA酶抑制剂、增强剂、去除基因组DNA试剂、还原剂和荧光染料中的一种或多种。
6.根据权利要求5所述的PCR预混液，其特征在于，所述PCR预混液满足以下条件中的一种或多种：
7.根据权利要求6所述的PCR预混液，其特征在于，所述PCR预混液包括以下工作浓度的各组分：
8.包括权利要求1～7任一项所述PCR预混液的试剂或试剂盒。
9.一种PCR扩增方法，其特征在于
10.权利要求1～7任一项所述PCR预混液或权利要求8所述的试剂或试剂盒用于慢病毒滴度测定；
...【技术特征摘要】
1.一种pcr预混液，其特征在于，所述pcr预混液包括聚乙二醇辛基苯基醚、辛基苯基-聚乙烯二醇、bsa和蓝色葡聚糖2000。
2.根据权利要求1所述的pcr预混液，其特征在于，所述pcr预混液包括以下工作浓度的组分：
3.根据权利要求1所述的pcr预混液，其特征在于，所述pcr预混液还包括适配体；
4.根据权利要求3所述的pcr预混液，其特征在于，所述适配体在所述pcr预混液中的工作浓度为0.05μm～1μm。
5.根据权利要求1～4任一项所述的pcr预混液，其特征在于，所述pcr预混液还包括酶、缓冲基质、dntps、阳离子、rna酶抑制剂、增强剂、...
【专利技术属性】
技术研发人员：肖晓文，华丽萍，曹文刚，宋辉，
申请(专利权)人：湖北擎科生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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