【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及细胞培养，尤其涉及一种含干细胞外泌体的培养液的配制及应用。
技术介绍
1、内皮组织是一种特别的上皮组织，而上皮组织是动物的四种生物组织之一。内皮细胞或血管内皮是一薄层的上皮细胞，由一层扁平细胞所组成。它不仅能完成血液和组织液的代谢交换，并且能合成和分泌多种生物活性物质，以保证血管正常的收缩和舒张，起到维持血管张力，调节血压以及凝血与抗凝平衡等特殊功能，进而保持血液的正常流动和血管的长期通畅。
2、基于内皮细胞重要的生理特性，研究者对它显出极大的研究热情，内皮细胞培养基的需求也日益强劲。然而，现阶段国内高校及生物医药公司所用细胞培养基大部分依靠进口，原代细胞及培养基国内需求量大，培养基市场仍存在各种各样问题亟待解决。有文献报道，骨髓间充质干细胞来源的外泌体可以被人脐静脉内皮细胞(huvecs)摄取，促进huvecs的增殖、迁移和管状形成(lu gd,cheng p,liu t,wang z.bmsc-derived exosomalmir-29a promotes angiogenesis and osteogenesis.front cell dev biol.2020dec 9；8:608521.)。
3、实验室常用m199添加10％胎牛血清培养原代内皮细胞及人微血管内皮细胞(hmec-1)等细胞，培养初期细胞状态良好，增殖速率快。对于原代内皮细胞，培养5代左右细胞胞体变大，增殖速率变慢。与专利cn104974978b、专利cn105969720b相比，本专利技术不再使用霍乱毒素，以更稳定
技术实现思路
1、本专利技术所要解决的技术问题是：提供一种含干细胞外泌体的培养液的配制方法，降低血替含量，并可适用于多种原代内皮细胞及内皮细胞系的培养。
2、本专利技术提供了一种含干细胞外泌体的培养液，主要用于内皮细胞培养，包括基础培养基，1％血替，添加物组合。添加物包含：重组表皮生长因子、重组碱性成纤维细胞生长因子、重组血管内皮生长因子、重组胰岛素样生长因子、重组转铁蛋白、重组人胰岛素、维生素c、氢化可的松、牛血清白蛋白、肝素、l-丙氨酰-l-谷氨酰胺、间充质干细胞外泌体。
3、优选地，上述基础培养基选自m199培养基、mcdb131培养基、m199/mcdb131培养基(m199培养基和mcdb131培养基1:1配制)，或者其他任何适用的贴壁培养基。
4、优选地，所述培养液中血替终浓度为1％。
5、优选地，所述培养液中添加物各组分成分和使用终浓度为：
6、重组表皮生长因子 5-20ng/ml
7、重组碱性成纤维细胞生长因子 1-5ng/ml
8、重组血管内皮生长因子 1-5ng/ml
9、重组胰岛素样生长因子 1-5ng/ml
10、重组转铁蛋白 5-20ug/ml
11、重组人胰岛素 1-10ug/ml
12、维生素c 1-5ug/ml
13、氢化可的松 1-5ug/ml
14、牛血清白蛋白 10-50ug/ml
15、肝素 20-100ug/ml
16、l-丙氨酰-l-谷氨酰胺(l-ala-l-gln) 1-2mm
17、间充质干细胞外泌体 1x107-1x108 particles/ml
18、优选地，所述间充质干细胞外泌体提取自p4-p5代间充质干细胞上清。
19、优选地，所述间充质干细胞经过低氧培养。
20、优选地，所述添加物预存于无菌管中，与基础培养基分开保存。
21、一种含干细胞外泌体的培养基的应用，其特征在于，原代内皮细胞分离包括以下步骤：
22、解剖大鼠剥离非动脉部分，分离得到大鼠主动脉，用d-hanks溶液漂洗；
23、用尖头镊子轻轻将主动脉内外翻转过来，用无菌线固定两端；
24、利用0.05％ii型胶原酶和0.1％iv型胶原酶的混合酶消化处理后的主动脉，在37℃摇床晃动，每30分钟显微镜下观察一次，并用移液枪轻轻吹打3次；
25、显微镜下观察大部分内皮细胞脱落，加入培养基终止消化，收集上清1000rmp离心,5分钟；
26、用培养基重悬并再次离心；
27、用配制好的完全培养基重悬大鼠主动脉内皮细胞并计数；
28、以约5x 104cell/ml的密度接种至细胞瓶，放入37℃,5％co2培养箱中培养。
29、待细胞融合度达到85％左右，消化细胞，以1:3的比例进行传代至10代以上，观察记录细胞状态。
30、本专利技术与现有技术相比，具有如下技术效果：
31、(1)本专利技术的内皮细胞培养液，相对于传统实验室自配培养基,大大减少了血清含量，并且能够适用于原代细胞和细胞株，能够有效地维持血管内皮细胞的性状；
32、(2)本专利技术与其他专利相比，不再使用霍乱毒素，以更稳定的l-ala-l-gln代替l-谷氨酰胺；
33、(3)本专利技术提出了间充质干细胞外泌体新的应用场景；
34、(4)本专利技术添加物预先混合并与基础分开保存，现用现配；
35、(5)本专利技术使用的大鼠主动脉内皮细胞分离培养方法，操作简单，细胞得率高，杂细胞少。
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1.一种含干细胞外泌体的培养液的配制，培养液主要用于内皮细胞培养，包括有基础培养基，1％血替，添加物组合。添加物包含：重组表皮生长因子、重组碱性成纤维细胞生长因子、重组血管内皮生长因子、重组胰岛素样生长因子、重组转铁蛋白、重组人胰岛素、维生素C、氢化可的松、牛血清白蛋白、肝素、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、间充质干细胞外泌体。
2.根据权利要求1所述的细胞培养液，其特征在于，所述基础培养基选自M199培养基、MCDB131培养基、M199/MCDB131培养基(M199培养基、MCDB131培养基1:1配制)。
3.根据权利要求1所述的细胞培养液，其特征在于，所述血替终浓度为1％。
4.根据权利要求1所述的细胞培养液，其特征在于，各组分使用终浓度为：
5.根据权利要求1所述的细胞培养液，其特征在于，所述间充质干细胞外泌体提取自P4-P5代间充质干细胞上清。
6.根据权利要求5所述的间充质干细胞外泌体，其特征在于，所述间充质干细胞经过低氧培养。
7.根据权利要求1所述的细胞培养液，其特征在于，所述添加物与基础培养基
8.根据权利要求1所述的细胞培养液，培养液最适合培养人源内皮细胞，但也可用于羊和鼠来源的内皮细胞等。
9.根据权利要求1所述的培养液的应用,其特征在于,原代内皮细胞分离包括以下步骤：
...【技术特征摘要】
1.一种含干细胞外泌体的培养液的配制，培养液主要用于内皮细胞培养，包括有基础培养基，1％血替，添加物组合。添加物包含：重组表皮生长因子、重组碱性成纤维细胞生长因子、重组血管内皮生长因子、重组胰岛素样生长因子、重组转铁蛋白、重组人胰岛素、维生素c、氢化可的松、牛血清白蛋白、肝素、l-丙氨酰-l-谷氨酰胺、间充质干细胞外泌体。
2.根据权利要求1所述的细胞培养液，其特征在于，所述基础培养基选自m199培养基、mcdb131培养基、m199/mcdb131培养基(m199培养基、mcdb131培养基1:1配制)。
3.根据权利要求1所述的细胞培养液，其特征在于，所述血替终浓度为1％...
【专利技术属性】
技术研发人员：汪巍巍，石亚宁，王健，
申请(专利权)人：安龄上海生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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