甘蓝植物的变异体检测方法技术

本发明专利技术涉及甘蓝(Brassica oleracea)植物的非整倍体的检测方法，所述方法包括下述工序：将从来源于被测甘蓝植物的试样中提取的DNA作为模板，使用对甘蓝植物的2条以上染色体各自具有特异性的DNA标记，实施实时PCR，根据得到的DNA标记间的扩增量的相对差来检测染色体的非整倍性。根据本发明专利技术，能够在种子的质量管理、育种研究的过程中，在具有常见分子生物学手段的实验室等中简便、准确且迅速地检验甘蓝品种中可能产生的变异体(染色体非整倍体)。

A method for the detection of variants in Cabbage

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】甘蓝植物的变异体检测方法对相关申请的引用本申请基于作为在先日本专利申请的日本特愿2017-157384号(申请日：2017年8月17日)主张优先权权益，日本特愿2017-157384号的全部公开内容通过引用并入本文。
本专利技术涉及甘蓝(Brassicaoleracea)作物变异体(染色体非整倍体(aneuploid))的检测方法。详细而言，本专利技术涉及针对甘蓝(以下有时简称为“B.oleracea”)作物中由于非整倍体而呈现出各种异常形态的个体、在任何生长期中均能够利用分子生物学手段准确且迅速地对它们进行分类并检测的方法。
技术介绍
十字花科植物是起源于中近东、地中海沿岸的植物种，芸薹(Brassica)属植物中包含农业上极为重要的作物。其中，甘蓝种是极为重要的植物种，其包括B.oleraceavar.capitata(卷心菜)、B.oleraceavar.italica(西兰花)、B.oleraceavar.botrytis(花椰菜)、B.oleraceavar.gemmifera(抱子甘蓝)、B.oleraceavar.gongyloides(苤蓝)、B.oleraceavar.acephara(叶牡丹、羽衣甘蓝)、及B.oleraceavar.albograbra(芥蓝)等。一般而言，对于甘蓝作物，已培育出利用了自交不亲和性(selfincompatibility，SI)或细胞质雄性不育(cytoplasmicmalesterility，CMS)性质的杂种第一代交配(F1)植物。F1品种与原生品种、固定种相比，显示出适应环境的优异能力、品种内的高度一致性，因此商业性利用价值高，在许多国家得到利用。另一方面，报道了即使是继承了双亲基因的F1品种，也会以一定的频率出现呈现异于寻常的形态的个体(文献V.Ruffio-Chable等，(2000)(非专利文献1))。通常，这样的变异个体作为农产品的价值极低，通常无法成为作为蔬果的出货对象。另外，在商品种子之中产生大量上述显示变异的个体时，很可能发展成商业上的重大问题，因此，种苗公司有时也需要将该批次废弃等应对措施。关于产生这样的变异体的原因，长期以来并未被阐明，仅有如下猜测：可能是采种时或蔬果栽培中的环境造成影响，或者突变、表观遗传变异等造成影响。另外，前述的变异体问题在向农家销售种子的种苗公司的质量管理现场也是极为棘手的问题。生产·销售F1种子的种苗公司会以商品种子的纯度检验为目的实施利用DNA标记、同工酶的检验。然而，这些变异个体就基因型而言显示为F1型，因此通常无法检测出来。因此，在检查现场，长期以来期待检验方法的开发。此外，在育种研究中，也需要改良品种特性以使得不会产生大量如上所述的变异个体。然而，如上所述的变异体在幼苗期难以从外观进行判断。因此，为了准确地计测变异体的产生率，需要在场圃大规模展开，由熟练的育种人员仔细地对各个体的特性进行调查。但是，这样的种植(growout)检验具有依赖于主观的一面，存在结果因判定人员而异的隐忧。此外，取决于植物的生长期、栽培环境，即使是熟练的育种人员也可能难以准确地进行判断，鉴于这样的背景，长期以来，种苗公司期待开发出使用幼苗的简易检验方法。例如，文献V.Chable等，(2009)(非专利文献2)中，记载了花椰菜F1品种中出现的异常形态由非整倍体导致的可能性。作为检测这样的非整倍体的常见方法，报道了一些使用流式细胞仪的实验例。然而，使用流式细胞仪的方法不易准确地检测1条染色体的差别，即使设置内源性对照，仍然可能发生如文献N.Roux等，(2003)(非专利文献3)中公开的数据那样变得难以判断的情况。另外，染色体的大小存在差异，最大的染色体与最小的染色体的基因组量之比有时达到近2倍。增加了较小的染色体的情况下，正常个体和非整倍体所显示的峰的差异极小，因此不易作出判断，检测灵敏度对结果的可靠性造成的影响较大。因此，使用流式细胞仪的方法存在于通常的实验室中无法实施大规模的检验等问题。另外，使用流式细胞仪的方法中，即使构建了可靠度高的实验体系，仍然存在以下问题：在多条染色体中产生非整倍性的植物的情况下，例如，对于1号染色体三体型(Trisomy)和2号染色体单体型(Monosomy)组合而成的非整倍体的情况，结果会因核中包含18条染色体而将其判定为正常个体，等等。此外，使用流式细胞仪的简易检验中，难以鉴定是哪条染色体中产生了非整倍性。取决于形成三体型的染色体，存在西兰花的2号、7号染色体三体型、花椰菜的1号、2号、7号染色体三体型这样尽管成熟期略有偏差、但能毫无问题地收获蔬果的类型，也存在作为非整倍体不会立即导致商品价值减弱的情况。因此，在现场，能够个别地判别三体型的类型是重要的。另外，从改进育种的观点考虑，哪条染色体容易三体型化也是重要的信息，因此，期待开发出能够简便地对各条染色体的详细的非整倍性进行分析的检验方法。在此前已报道过在植物中利用PCR进行的使用了DNA标记的基因型判别方法。例如，日本专利第3836451号(专利文献1)中公开了与辣椒属植物辛辣成分产生相关的基因型的判定方法。然而，据本申请的专利技术人所知，迄今为止尚未报道其在十字花科植物的变异体的检验方法中的应用。现有技术文献专利文献专利文献1：日本专利第3836451号非专利文献非专利文献1：V.Ruffio-Chable等，ISHSActaHorticulturae539(2000)p89，Developmentally“Aberrant”plantsinF1hybridsofBrassicaoleracea.非专利文献2：V.Chable等，Euphytica170(2009)p275，“Aberrant”plantsincauliflower：2.AneuploidyandglobalDNAmethylation.非专利文献3：N.Roux等，PlantCellReport21(2003)p483，RapiddetectionofaneuploidyinMusausingflowcytometry.非专利文献4：I.Parkin等，Genetics171(2005)p765，SegmentalstructureoftheBrassicanapusgenomebasedoncomparativeanalysiswithArabidopsisthaliana.非专利文献5：X.Cheng等，TheoreticalAppliedGenetics118(2009)p1121，DevelopmentandgeneticmappingofmicrosatellitemarkersfromgenomesurveysequencesinBrassicanapus
技术实现思路
专利技术所要解决的课题本专利技术的目的在于上述以往的问题点，即，提供能够在种子的质量管理、育种研究的过程中准确且迅速地检验甘蓝品种中可能产本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.甘蓝(Brassica oleracea)植物的非整倍体的检测方法，所述方法包括下述工序：/n将从来源于被测甘蓝植物的试样中提取的DNA作为模板，使用对甘蓝植物的2条以上染色体各自具有特异性的DNA标记，实施实时PCR，根据得到的DNA标记间的扩增量的相对差来检测染色体的非整倍性。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170817 JP 2017-1573841.甘蓝(Brassicaoleracea)植物的非整倍体的检测方法，所述方法包括下述工序：
将从来源于被测甘蓝植物的试样中提取的DNA作为模板，使用对甘蓝植物的2条以上染色体各自具有特异性的DNA标记，实施实时PCR，根据得到的DNA标记间的扩增量的相对差来检测染色体的非整倍性。


2.如权利要求1所述的方法，其包括下述工序：
作为所述DNA标记，使用对甘蓝植物的1号染色体至9号染色体的全部染色体各自具有特异性的DNA标记，
判定被测植物是否为针对全部染色体之中的任何染色体的非整倍体。


3.如权利要求1或2所述的方法，其中，使用下述引物作为所述DNA标记，所述引物仅对甘蓝植物的任意一条染色体DNA具有特异性，且在该染色体DNA存在时能使得PCR反应导致的扩增产物生成。


4.如权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，作为所述DNA标记，使用：
(i)引物，其仅对甘蓝植物的任意一条染色体DNA具有特异性，且在该染色体DNA存在时能使得PCR反应导致的扩增产物生成；和
(ii)探针，其对与所述(i)的任意一条染色体DNA相同的染色体DNA具有特异性，且能检测基于所述(i)的引物的PCR反应导致的扩增产物。


5.如权利要求3或4所述的方法，其中，使用能与通过PCR反应合成的双链DNA结合而发出荧光的嵌入剂，或者，使用经荧光色素修饰从而能通过PCR延伸...

【专利技术属性】
技术研发人员：泉田敦，铃木隆夫，平本哲也，
申请(专利权)人：坂田种苗株式会社，
类型：发明
国别省市：日本;JP