被检样品中的细菌数的定量方法技术

本发明专利技术的课题在于提供能够使用PCR法迅速且精度良好地定量被检样品中的细菌菌数的方法。作为解决上述课题的方法，利用以下的工序进行被检样品中的细菌的鉴定及定量。(1)第一PCR工序，以来源于被检样品的核酸作为模板，使用用于扩增细菌的16S rRNA基因的通用引物对，利用PCR法得到第一扩增产物；(2)第二PCR工序，使用用于扩增利用前述第一PCR工序得到的第一扩增产物所具有的序列的内部序列的引物对，利用巢式PCR法得到第二扩增产物；以及(3)菌数定量工序，使用校准用的数据，从由前述第二PCR工序得到的第二扩增产物的量求出前述被检样品中的细菌数。另外，也可以在上述的工序(1)～(3)的基础上追加以下的工序(4)及(5)。(4)菌种鉴定工序，对前述被检样品中的细菌的菌种进行鉴定。(5)细菌数校正工序，以由前述菌数定量工序求出的细菌数作为暂定细菌数，基于前述对照细菌及由前述菌种鉴定工序鉴定出的菌种的16S rRNA操纵子拷贝数来校正暂定细菌数，从而确定前述被检样品中的细菌数。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】被检样品中的细菌数的定量方法
本专利技术涉及使用PCR法迅速且精度良好地进行被检样品、特别是血液被检样品中的细菌数的定量、或者细菌数的定量及细菌菌种的鉴定的方法。
技术介绍
败血症的重症度判定中所使用的传统检查项目为血液培养、内毒素、降钙素原、白细胞数、CRP(C-reactiveprotein，C-反应蛋白)、血压、体温、呼吸数、脉搏数等，最近新增加了Presepsin(可溶性CD14亚型，sCD14-ST)。由于血液培养结果需要时间，因此难以反馈到早期治疗中。由于白细胞数、CRP是宿主侧的感染防御反应，因此检查值与重症度产生时间差，常常成为与实际的重症度背离的值。降钙素原在特异性、定量性方面存在困难，从而难以应用。Presepsin无法用于肾功能障碍的患者。这样一来，作为实时地反映感染症的重症度、治疗效果的指标，还不存在值得信赖的检查项目。如果可能，以患者被检样品中的菌数作为生物标记而用作感染症重症度的判定或监测治疗效果的指标是最直接的，也是合理的。目前，被检样品中的菌数的标准定量分析通过培养所采集的患者被检样品来进行，但只是非常粗略的定量(仅分类为“1+”、“2+”、“3+”)。培养技术虽然被长年利用，但是检查耗费时间(通常为2～3天)，而且依赖于每个菌种不同的增殖能力，因此使用菌落形成单位(Colony-formingunit，CFU)的定量结果的可靠性低。因此，为了进行细菌数的正确测定，优选不依赖于培养的测定法。近年来，认为在除培养以外的方法中通用性最高的技术是定量PCR(实时PCR)法。尝试利用实时PCR法对患者被检样品中的致病菌进行定量的情况下，在检查开始的时刻不鉴定致病菌，另外，混合感染也可能经常发生，因此需要使用细菌通用引物(bacterialuniversal引物)(其是检测几乎所有细菌的引物，以下有时简单记载为“通用引物”。)。但是，患者被检样品中的致病菌常常是少量的，因此有时在通常的实时PCR中不能达到足以正确定量的充分的灵敏度。另外，即使得到充分的灵敏度，在细菌通用PCR(bacterialuniversalPCR)(其为检测几乎所有细菌的PCR)中也会存在污染容易被检测的问题，在致病菌的判定中产生困难。其结果为：患者被检样品中的致病菌的定量检查尽管对于感染症治疗非常有用，但是因技术上未解决的问题而还未达到实用化。关于利用PCR法的感染症病原菌的鉴定方法，在专利文献1中公开了下述感染症病原菌的迅速鉴定方法：使用来源于被检样品的核酸，使用多个特定引物组进行实时PCR，并使用所得的多个扩增产物的熔解温度(Tm值)的组合，对被检样品中的菌进行鉴定。在专利文献2中公开了可实现检测灵敏度提高的真核生物生产的耐热性DNA聚合酶和基于使用了该耐热性DNA聚合酶的PCR法的细菌菌种的鉴定方法。在专利文献3中公开了如下用途的多个引物对：使用来源于被检样品的核酸进行实时PCR，使用所得的扩增产物的熔解温度(Tm值)对被检样品中的菌进行鉴定。现有技术文献专利文献专利文献1：国际公开2007/097323号专利文献2：国际公开2010/082640号专利文献3：国际公开2015/053293号
技术实现思路
专利技术要解决的课题在用以往的PCR法分析败血症中的血液被检样品等被检样品中微量地含有的致病菌的菌数或其菌种的情况下，现状是还残存下述的课题。在通常的实时PCR中，有时无法得到足以正确地定量患者被检样品中的致病菌数的充分的灵敏度。尤其在致病菌极微量的情况下，有时不能用实时PCR正确地定量。本专利技术的目的在于提供能够使用PCR法迅速且精度良好地进行被检样品中的细菌数的定量、或者细菌数的定量及细菌菌种的鉴定的方法。用于解决课题的手段本专利技术涉及的对被检样品中的细菌数进行定量的第一定量方法的一个实施方式，其特征在于，具有以下的工序。(1)第一PCR工序，以来源于被检样品的核酸作为模板，使用细菌的16SrRNA基因的扩增用通用引物对，利用PCR法得到第一扩增产物；(2)第二PCR工序，使用用于对通过前述第一PCR工序得到的第一扩增产物所具有的序列的内部序列进行扩增的引物对，利用巢式PCR法得到第二扩增产物；以及(3)菌数定量工序，使用表示来源于菌种已知的对照细菌的扩增产物的量与前述对照细菌的细菌数的关系的校准用的数据，由通过前述第二PCR工序得到的第二扩增产物的量求出前述被检样品中的细菌数。本专利技术涉及的对被检样品中的细菌数进行定量的第一定量方法的一个实施方式，其特征在于，具有以下的工序。(A)第一PCR工序，以来源于被检样品的核酸作为模板，使用细菌的16SrRNA基因的扩增用通用引物对，利用PCR法得到第一扩增产物；(B)第二PCR工序，使用用于对通过前述第一PCR工序得到的第一扩增产物所具有的序列的内部序列进行扩增的引物对，利用巢式PCR法得到第二扩增产物；(C)第三PCR工序，使用与菌种已知的对照细菌的已知细菌数对应的核酸试样，利用PCR法得到第三扩增产物；(D)第四PCR工序，使用通过前述第三PCR工序得到的第三扩增产物，利用巢式PCR法得到第四扩增产物；(E)由前述已知的菌数和前述第四扩增产物的量制作校准用的数据的工序；以及(F)菌数定量工序，使用前述校准用的数据，由通过前述第二PCR工序得到的第二扩增产物的量求出前述被检样品中的细菌数。本专利技术涉及的对被检样品中的细菌数进行定量的第二定量方法的一个实施方式，其特征在于，具有以下的工序。(1)第一PCR工序，以来源于被检样品的核酸作为模板，使用细菌的16SrRNA基因的扩增用通用引物对，利用PCR法得到第一扩增产物；(2)第二PCR工序，使用用于对通过前述第一PCR工序得到的第一扩增产物所具有的序列的内部序列进行扩增的引物对，利用巢式PCR法得到第二扩增产物；(3)菌数定量工序，使用表示来源于菌种已知的对照细菌的扩增产物的量与前述对照细菌的细菌数的关系的校准用的数据，由通过前述第二PCR工序得到的第二扩增产物的量求出前述被检样品中的暂定细菌数；(4)菌种鉴定工序，对前述被检样品中的细菌的菌种进行鉴定；以及(5)细菌数校正工序，基于前述对照细菌及通过前述菌种鉴定工序所鉴定的菌种的16SrRNA操纵子拷贝数对通过前述菌数定量工序求出的暂定细菌数进行校正，从而确定前述被检样品中的细菌数。本专利技术涉及的对被检样品中的细菌数进行定量的第二定量方法的一个实施方式，其特征在于，具有以下的工序。(A)第一PCR工序，以来源于被检样品的核酸作为模板，使用细菌的16SrRNA基因的扩增用通用引物对，利用PCR法得到第一扩增产物；(B)第二PCR工序，使用用于对通过前述第一PCR工序得到的第一扩增产物所具有的序列的内部序列进行扩增的引物对，利用巢式PCR法得到第二扩增产物；(C)第三PCR工序，使用与菌种已知的对照细菌的已知细菌本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.对被检样品中的细菌数进行定量的方法，其特征在于，具有以下的工序：/n(1)第一PCR工序，以来源于被检样品的核酸作为模板，使用细菌的16S rRNA基因的扩增用通用引物对，利用PCR法得到第一扩增产物；/n(2)第二PCR工序，使用用于对通过所述第一PCR工序得到的第一扩增产物所具有的序列的内部序列进行扩增的引物对，利用巢式PCR法得到第二扩增产物；以及/n(3)菌数定量工序，使用表示来源于菌种已知的对照细菌的扩增产物的量与所述对照细菌的细菌数的关系的校准用的数据，由通过所述第二PCR工序得到的第二扩增产物的量求出所述被检样品中的细菌数。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20171222 JP 2017-246333;20171222 JP 2017-2467241.对被检样品中的细菌数进行定量的方法，其特征在于，具有以下的工序：
(1)第一PCR工序，以来源于被检样品的核酸作为模板，使用细菌的16SrRNA基因的扩增用通用引物对，利用PCR法得到第一扩增产物；
(2)第二PCR工序，使用用于对通过所述第一PCR工序得到的第一扩增产物所具有的序列的内部序列进行扩增的引物对，利用巢式PCR法得到第二扩增产物；以及
(3)菌数定量工序，使用表示来源于菌种已知的对照细菌的扩增产物的量与所述对照细菌的细菌数的关系的校准用的数据，由通过所述第二PCR工序得到的第二扩增产物的量求出所述被检样品中的细菌数。


2.如权利要求1所述的对被检样品中的细菌数进行定量的方法，其特征在于，具有以下的工序：
(A)第一PCR工序，以来源于被检样品的核酸作为模板，使用细菌的16SrRNA基因的扩增用通用引物对，利用PCR法得到第一扩增产物；
(B)第二PCR工序，使用用于对通过所述第一PCR工序得到的第一扩增产物所具有的序列的内部序列进行扩增的引物对，利用巢式PCR法得到第二扩增产物；
(C)第三PCR工序，使用与菌种已知的对照细菌的已知细菌数对应的核酸试样，利用PCR法得到第三扩增产物；
(D)第四PCR工序，使用通过所述第三PCR工序得到的第三扩增产物，利用巢式PCR法得到第四扩增产物；
(E)由所述已知的菌数和所述第四扩增产物的量制作校准用的数据的工序；以及
(F)菌数定量工序，使用所述校准用的数据，由通过所述第二PCR工序得到的第二扩增产物的量求出所述被检样品中的细菌数。


3.如权利要求2所述的对被检样品中的细菌数进行定量的方法，其中，通过以下的工序进行所述工序(C)、(E)及(F)：
(C-1)第三PCR工序，分别使用与菌种已知的对照细菌的不同的多个已知细菌数对应的多个核酸试样，利用PCR法得到第三扩增产物；
(E-1)从所述已知的菌数和所述第四扩增产物的量制作校准曲线的工序；以及
(F-1)菌数定量工序，使用所述校准曲线，由通过所述第二PCR工序得到的第二扩增产物的量求出所述被检样品中的细菌数。


4.如权利要求1～3中任一项所述的对被检样品中的细菌数进行定量的方法，其特征在于，以所述第一PCR工序中的基因扩增未到达平台期的循环数进行所述第一PCR工序。


5.如权利要求1～4中任一项所述的对被检样品中的细菌数进行定量的方法，其特征在于，具有将包含所述第一扩增产物的反应液进行稀释而供于所述第二PCR工序的稀释工序。


6.如权利要求2～5中任一项所述的对被检样品中的细菌数进行定量的方法，其特征在于，在同一PCR装置内同时进行所述第一PCR工序和所述第三PCR工序，并且在同一PCR装置内同时进行所述第二PCR工序和所述第四PCR工序。


7.如权利要求1～6中任一项所述的对被检样品中的细菌数进行定量的方法，其特征在于，还具有下述工序：分别使用多个引物对进行第二PCR工序，基于经各引物对所扩增的多个扩增产物的熔解温度(Tm值)的组合或Tm值间的差值的组合，对所述被检样品中的细菌的菌种进行鉴定。


8.如权利要求7所述的对被检样品中的细菌数进行定量的方法，其特征在于，使用所述第二PCR工序用的多个引物对中的至少1者进行所述第四PCR工序(其中，在使用多个引物对的情况下，分别使用多个引物对进行第四PCR工序)。


9.如权利要求1～8中任一项所述的对被检样品中的细菌数进行定量的方法，其特征在于，所述对照细菌为大肠杆菌。


10.如权利要求1～9中任一项所述的对被检样品中的细菌数进行定量的方法，在所述第一PCR工序中使用的通用引物对中，正向引物、反向引物中的一者或两者为等量地混合有1个碱基不同的2种引物而成的。


11.对被检样品中的细菌数进行定量的方法，其特征在于，具有以下的工序：
(1)第一PCR工序，以来源于被检样品的核酸作为模板，使用细菌的16SrRNA基因的扩增用通用引物对，利用PCR法得到第一扩增产物；
(2)第二PCR工序，使用用于对通过所述第一PCR工序得到的第一扩增产物所具有的序列的内部序列进行扩增的引物对，利用巢式PCR法得到第二扩增产物；
(3)菌数定量工序，使用表示来源于菌种已知的对照细菌的扩增产物的量与所述对照细菌的细菌数的关系的校准用的数据，由通过所述第二PCR工序得到的第二扩增产物的量求出所述被检样品中的暂定细菌数；
(4)菌种鉴定工序，对所述被检样品中的细菌的菌种进行鉴定；以及
(5)细菌数校正工序，基于所述对照细菌及通过所述菌种鉴定工序所鉴定的菌种的16SrRNA操纵子拷贝数对通过所述菌数定量工序求出的暂定细菌数进行校正，从而确定所述被检样品中的细菌数。


12.如权利要求11所述的对被检样品中的细菌数进行定量的方法，其特征在于，具有以下的工序：
(A)第一PC...

【专利技术属性】
技术研发人员：仁井见英树，北岛勋，宫腰晃央，东祥嗣，
申请(专利权)人：三井化学株式会社，国立大学法人富山大学，
类型：发明
国别省市：日本;JP