【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】能从无细胞合成中获得的封闭端DNA载体和用于获得ceDNA载体的方法相关申请的交叉引用本申请根据35U.S.C.§119(e)要求2018年1月19日提交的美国临时申请62/619,392的权益，所述美国临时申请的内容通过全文引用的方式并入本文中。序列表本申请含有序列表，其已经以ASCII格式电子提交并在此通过全文引用的方式并入。所述ASCII拷贝创建于2019年1月17日，名为080170-091310-WOPT_SL.txt并且大小为102,804字节。
本专利技术涉及基因疗法领域，包括产生用于在受试者或细胞中表达转基因或分离的多核苷酸的非病毒载体。例如，本公开提供了合成非病毒DNA载体的无细胞方法。本公开还涉及到由此产生的核酸构建体和它们的使用方法。
技术介绍
基因疗法旨在改善患有因基因表达谱畸变引起的基因突变或获得性疾病的患者的临床结局。基因疗法包括治疗或预防因可能导致病症、疾病、恶性病等的缺陷基因或者异常调节或表达、例如表达不足或过表达所引起的医学状况。例如，可以通过向患者递送矫正性遗传物质来治疗、预防或改善由缺陷基因引起的疾病或病症，或可以通过例如对患者用矫正性遗传物质改变或沉默缺陷基因，使得该遗传物质在患者体内发生治疗性表达来治疗、预防或改善。基因疗法的基础是提供具有活性基因产物(有时称为转基因)的转录盒，所述活性基因产物例如可以产生正功能获得性作用、负功能获得性作用或其它结局。基因疗法也可以用于治疗由其它因素引起的疾病或恶性病。人类单基因病症可以通过将正...
【技术保护点】
1.一种制备封闭端DNA载体的方法，其包含：/n提供包含第一ITR的第一单链ITR分子；/n提供包含第二ITR的第二单链ITR分子；/n提供包含表达盒序列的双链多核苷酸；以及/n将所述第一ITR分子的5'和3'末端连接至所述双链分子的第一末端，并将所述第二ITR分子的5'和3'末端连接至所述双链分子的第二末端以形成所述DNA载体。/n
【技术特征摘要】 【专利技术属性】
【国外来华专利技术】20180119 US 62/619,3921.一种制备封闭端DNA载体的方法，其包含：
提供包含第一ITR的第一单链ITR分子；
提供包含第二ITR的第二单链ITR分子；
提供包含表达盒序列的双链多核苷酸；以及
将所述第一ITR分子的5'和3'末端连接至所述双链分子的第一末端，并将所述第二ITR分子的5'和3'末端连接至所述双链分子的第二末端以形成所述DNA载体。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一ITR和所述第二ITR中的至少一个是合成的。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述双链表达盒序列是通过从包含所述表达盒序列的双链DNA构建体上切除而获得的。
4.根据权利要求3所述的方法，其中在所述双链DNA构建体中，所述表达盒序列在所述5'末端侧接第一限制性核酸内切酶裂解位点，并且在所述3'末端侧接第二限制性核酸内切酶裂解位点。
5.根据权利要求3或权利要求4所述的方法，其中所述双链DNA构建体是杆粒、质粒、微环或线性双链DNA分子。
6.根据权利要求4所述的方法，其中所述第一限制性核酸内切酶和所述第二限制性核酸内切酶是相同的限制性核酸内切酶。
7.根据权利要求4所述的方法，其中所述第一限制性核酸内切酶和所述第二限制性核酸内切酶是不同的限制性核酸内切酶。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在连接至所述表达盒序列之前将所述第一ITR和所述第二ITR中的至少一个退火。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一ITR和所述第二ITR中的至少一个包含分别与所述表达盒序列的所述第一末端或所述表达盒序列的所述第二末端互补的悬垂区域。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述连接选自化学连接和蛋白质辅助连接。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述连接是通过T4连接酶或AAVRep蛋白实现的。
12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一ITR选自野生型ITR和修饰ITR。
13.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述第二ITR选自野生型ITR和修饰ITR。
14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一ITR和所述第二ITR中的至少一个包含至少一个RBE位点。
15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一ITR和所述第二ITR中的至少一个为AAVITR或AAV衍生的ITR。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述第一ITR的序列选自表4B或表5中阐述的任何左ITR序列或SEQIDNO:2、5-9、32-48。
17.根据权利要求15所述的方法，其中所述第二ITR的序列选自表4A或表5中阐述的任何右ITR序列或SEQIDNO:1、3、10-14、15-31。
18.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述表达盒序列包含至少一个顺式调节元件。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述顺式调节元件选自由启动子、增强子、转录后调节元件和多聚腺苷酸化信号组成的群组。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述转录后调节元件包含WHP转录后调节元件(WPRE)。
21.根据权利要求19所述的方法，其中所述启动子选自由CAG启动子、AAT启动子、LP1启动子和EF1a启动子组成的群组。
22.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述表达盒序列包含转基因序列。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述转基因序列的长度为至少2000个核苷酸。
24.根据权利要求22所述的方法，其中所述转基因序列编码蛋白质。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述转基因序列编码报告蛋白、治疗性蛋白、抗原、基因编辑蛋白或细胞毒性蛋白。
26.根据权利要求22所述的方法，其中所述转基因序列是功能性核苷酸序列。
27.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述封闭端DNA载体是ceDNA载体。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述ceDNA载体是纯化的。
29.一种封闭端DNA载体，其通过根据前述权利要求中任一项所述的方法生成。
30.一种药物组合物，其包含根据权利要求29所述的封闭端DNA载体和任选地赋形剂。
31.一种制备封闭端DNA载体的方法，其包含：
使包含以下的双链DNA构建体与一种或多种限制性核酸内切酶接触：
表达盒；
在所述表达盒上游(5'-末端)的第一ITR；
在所述表达盒下游(3'-末端)的第二ITR；
以及位于所述ITR两侧的至少两个限制性核酸内切酶裂解位点，使得所述限制性核酸内切酶位于所述表达盒的远端，
所述限制性核酸内切酶能在所述限制性核酸内切酶裂解位点处使所述双链DNA构建体裂解，以从所述双链DNA构建体切除介于所述限制性核酸内切酶裂解位点之间的序列；以及连接所切除的序列的所述5'和3'末端以形成封闭端DNA载体。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述双链DNA构建体是杆粒、质粒、微环或线性双链DNA分子。
33.根据权利要求31或32所述的方法，其中使用单个限制性核酸内切酶进行所述切除。
34.根据权利要求31或32所述的方法，其中使用两种不同的限制性核酸内切酶进行所述切除。
35.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述连接选自化学连接和蛋白质辅助连接。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述连接是通过T4连接酶或AAVRep蛋白实现的。
37.根据权利要求31至36中任一项所述的方法，其中所述第一ITR选自野生型ITR和修饰ITR。
38.根据权利要求31至37中任一项所述的方法，其中所述第二ITR选自野生型ITR和修饰ITR。
39.根据权利要求31至38中任一项所述的方法，其中所述第一ITR和所述第二ITR中的至少一个包含至少一个RBE位点。
40.根据权利要求31至39中任一项所述的方法，其中所述第一ITR和所述第二ITR中的至少一个为AAVITR或AAV衍生的ITR。
41.根据权利要求31至40中任一项所述的方法，其中所述第一ITR的序列选自表4B或表5中阐述的任何左ITR序列或SEQIDNO:2、5-9、32-48。
42.根据权利要求31至41中任一项所述的方法，其中所述第二ITR的序列选自表4A或表5中阐述的任何右ITR序列或SEQIDNO:1、3、10-14、15-31。
43.根据权利要求31至42中任一项所述的方法，其中所述表达盒序列包含至少一个顺式调节元件。
44.根据权利要求31至43中任一项所述的方法，其中所述顺式调节元件选自由启动子、增强子、转录后调节元件和多聚腺苷酸化信号组成的群组。
45.根据权利要求44所述的方法，其中所述转录后调节元件包含WHP转录后调节元件(WPRE)。
46.根据权利要求44所述的方法，其中所述启动子选自由CAG启动子、AAT启动子、LP1启动子和EF1a启动子组成的群组。
47.根据权利要求31至46中任一项所述的方法，其中所述表达盒序列包含转基因序列。
48.根据权利要求47所述的方法，其中所述转基因序列的长度为至少2000个核苷酸。
49.根据权利要求47所述的方法，其中所述转基因序列编码蛋白质。
50.根据权利要求49所述的方法，其中所述转基因序列编码报告蛋白、治疗性蛋白、抗原、基因编辑蛋白或细胞毒性蛋白。
51.根据权利要求47所述的方法，其中所述转基因序列是功能性核苷酸序列。
52.根据权利要求31至51中任一项所述的方法，其中所述封闭端DNA载体是ceDNA载体。
53.根据权利要求52所述的方法，其中所述ceDNA载体是纯化的。
54.一种封闭端DNA载体，其通过根据权利要求31至54中任一项所述的方法生成。
55.一种药物组合物，其包含根据权利要求54所述的封闭端DNA载体和任选地赋形剂。
56.一种制备DNA载体的方法，其包含：
合成按5'至3'方向依次包含以下的单链DNA分子：
有义第一ITR；
有义表达盒序列；
有义第二ITR；
反义第二ITR；
反义表达盒序列；以及
反义第一ITR；
由所述单链分子形成包含发夹的多核苷酸；以及连接所述5'和3'末端以形成封闭端DNA载体。
57.根据权利要求56所述的方法，其中所述有义第一ITR、所述有义表达盒序列、所述有义第二ITR、所述反义第二ITR、所述反义表达盒序列和所述反义第一ITR中的至少一个是合成的。
58.根据权利要求56或57所述的方法，其中所述单链DNA分子是通过以下来构建：将所述有义第一ITR、所述有义表达盒序列、所述有义第二ITR、所述反义第二ITR、所述反义表达盒序列以及所述反义第一ITR中的一个或多个合成为寡核苷酸，并将所述寡核苷酸连接以形成所述单链DNA分子。
59.根据权利要求56或57所述的方法，其中所述单链DNA分子是通过从双链DNA多核苷酸中切除所述分子，然后使所切除的双链片段变性以产生所述单链DNA分子来提供。
60.根据权利要求56至59中任一项所述的方法，其中由所述单链分子形成包含发夹的多核苷酸的所述步骤是通过在使所述ITR中的一个或多个形成发夹环的条件下将所述单链分子退火来实现的。
61.根据权利要求56至60中任一项所述的方法，其中所述连接选自化学连接和蛋白质辅助连接。
62.根据权利要求61所述的方法，其中所述连接是通过T4连接酶或AAVRep蛋白实现的。
63.根据权利要求56至62中任一项所述的方法，其中所述有义第一ITR选自野生型ITR和修饰ITR。
64.根据权利要求56至63中任一项所述的方法，其中所述有义第二ITR选自野生型ITR和修饰ITR。
65.根据权利要求56至64中任一项所述的方法，其中所述有义第一ITR、所述反义第一ITR、所述有义第一ITR和所述反义第二ITR中的至少一个包含至少一个RBE位点。
66.根据权利要求56至65中任一项所述的方法，其中所述有义第一ITR和所述有义第二ITR中的至少一个为AAVITR或AAV衍生的ITR。
67.根据权利要求66所述的方法，其中所述有义第一ITR的序列选自表4B或表5中阐述的任何左ITR序列或SEQIDNO:2、5-9、32-48。
68.根据权利要求66所述的方法，其中所述第二ITR的序列选自表4A或表5中阐述的任何右ITR序列或SEQIDNO:1、3、10-14、15-31。
69.根据权利要求56至68中任一项所述的方法，其中所述有义表达盒序列包含至少一个顺式调节元件。
70.根据权利要求69所述的方法，其中所述顺式调节元件选自由启动子、增强子、转录后调节元件和多聚腺苷酸化信号组成的群组。
71.根据权利要求70所述的方法，其中所述转录后调节元件包含WHP转录后调节元件(WPRE)。
72.根据权利要求70所述的方法，其中所述启动子选自由CAG启动子、AAT启动子、LP1启动子和EF1a启动子组成的群组。
73.根据权利要求56至72中任一项所述的方法，其中所述有义表达盒序列包含转基因序列。
74.根据权利要求73所述的方法，其中所述转基因序列的长度为至少2000个核苷酸。
75.根据权利要求73所述的方法，其中所述转基因序列编码蛋白质。
76.根据权利要求75所述的方法，其中所述转基因序列编码报告蛋白、治疗性蛋白、抗原、基因编辑蛋白或细胞毒性蛋白。
77.根据权利要求73所述的方法，其中所述转基因序列是功能性核苷酸序列。
78.根据权利要求56至77中任一项所述的方法，其中所述封闭端DNA载体是ceDNA载体。
79.根据权利要求78所述的方法，其中所述ceDNA载体是纯化的。
80.一种封闭端DNA载体，其通过根据权利要求56至79中任一项所述的方法生成。
81.一种药物组合物，其包含根据权利要求80所述的封闭端DNA载体和任选地赋形剂。
技术研发人员：O·阿尔坎，R·M·科廷，M·斯坦顿，D·A·科尔，C·佩尔蒂埃，
申请(专利权)人：世代生物公司，
类型：发明
国别省市：美国;US
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