本发明专利技术公开了一种有效的低分子量RNA分离纯化方法，包括按照Trizol法提取总RNA，获得总RNA溶液；利用聚乙二醇和NaCl溶液对总RNA溶液进行处理，离心收集上清液；向上清液中加入无水乙醇，得到RNA沉淀物；用体积浓度为75‑80％的乙醇清洗RNA沉淀物，自然晾干，然后溶于DEPC水中，获得富集的RNA溶液；对富集的RNA溶液进行聚丙烯酰氨凝胶电泳分离，最后回收纯化低分子量RNA。本发明专利技术提供的一种有效的低分子量RNA分离纯化方法，克服了传统方法的缺陷，可以有效的分离出长度介于10‑30nt的低分子量RNA，并且由本发明专利技术的方法分离出的低分子量RNA纯度和含量均较高。本发明专利技术还公开了一种有效的低分子量RNA分离纯化方法，在提取植物中低分子量RNA的应用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，具体涉及一种有效的低分子量RNA分离纯化方法及其应用。
技术介绍
长度介于10-30nt之间的低分子量RNA，尤其是长度介于20-25nt的miRNAs，miRNAs是一类重要的低分子量RNA，其具有很高的稳定性，在反复冻融、pH改变以及RNA裂解酶的作用下都不易降解。现代科学研究发现，低分子量RNA对植物的生长、发育等起着重要的调控作用，为了保证研究低分子量RNA生物功能的科学实验能够顺利的开展，不受到多糖、多酚等物质的影响，有必要分离出高质量、高含量的低分子量RNA。然而，由于低分子量RNA的碱基片段较小，在总RNA中含量甚微，尤其是长度介于10-30nt之间的RNA。由于其分子量极低，在离心时不易沉淀，按照传统的从总RNA中回收低分子量RNA的方法，容易导致低分子量RNA跟随弃掉的上清液流失，无法分离回收低分子量RNA的问题。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种有效的低分子量RNA分离纯化方法及其应用，解决了现有从总RNA中回收低分子量RNA的方法，容易导致低分子量RNA跟随弃掉的上清液流失，无法分离回收低分子量RNA的问题。本专利技术提供了一种有效的低分子量RNA分离纯化方法，包括以下步骤：步骤1，按Trizol法提取总RNA，获得总RNA溶液，用DEPC水将总RNA溶液的浓度调至1μg/μL；步骤2，取一定体积的总RNA溶液，分别加入相当于总RNA溶液1/10体积的40-60％聚乙二醇和相当于总RNA溶液1/10体积的4-6M NaCl溶液，混合均匀，冰浴30min，然后于4℃、15000rmp离心10min，收集上清液；步骤3，向步骤2的上清液中加入相当于上清液2.5倍体积的无水乙醇，然后于-20℃放置2-3h，之后于4℃、15000rpm离心1-1.5h，弃去上清液，得到RNA沉淀物；步骤4，用体积浓度为75-80％的乙醇清洗RNA沉淀物2次，自然晾干，并将自然晾干后的RNA沉淀物溶于一定体积的DEPC水中，获得富集的RNA溶液；步骤5，制备聚丙烯酰氨质量分数为15％变性聚丙烯酰氨凝胶，并在200V电压下预电泳15-30min；步骤6，配制一定体积的RNA样品点样溶液，所述RNA样品点样溶液按照以下步骤配制：步骤4中富集的RNA溶液和2×上样缓冲液，按1∶1的体积比涡旋混匀，65℃保温5-10min，然后放于冰上保存备用；步骤7，配制一定体积的marker溶液，所述marker溶液按照以下步骤配制：2×上样缓冲液和包含10-500nt的DNAmarker，按1∶1的体积比涡旋混匀，65℃保温5-10min，然后放于冰上保存备用；步骤8，将步骤6的RNA样品点样溶液和步骤7的marker溶液分别点样于变性聚丙烯酰氨凝胶中，200V电压下电泳1h，然后取出变性聚丙烯酰氨凝胶，并用浓度为1μg/μL的EB溶液浸泡染色5min，最后回收并纯化变性聚丙烯酰氨凝胶中的低分子量RNA，获得低分子量RNA溶液。优选的，本专利技术提供的一种有效的低分子量RNA分离纯化方法，步骤8中，按以下步骤回收并纯化变性聚丙烯酰氨凝胶中的低分子量RNA：步骤1)，切下变性聚丙烯酰氨凝胶上含有低分子量RNA的凝胶块，放于2mL离心管中，捣碎成凝胶碎粒，然后加入相当于凝胶碎粒2倍体积的0.3M NaCl溶液，混匀，室温静置12-15h，获得凝胶溶液；步骤2)，将凝胶溶液转移至RNA过滤柱中，于4℃、13000-15000rpm离心1min，弃去凝胶碎粒，收集过滤液；步骤3)，向过滤液中分别加入3μL质量浓度为5mg/mL的糖原和相当于过滤液2.5倍体积的无水乙醇，混匀，于-80℃静置2-12h，然后于4℃、15000rpm离心30min，并弃去上清液，得到低分子量RNA沉淀物；步骤4)，用体积浓度为75-80％的乙醇清洗低分子量RNA沉淀物2次，然后自然晾干，并将晾干后的低分子量RNA沉淀物溶于10μL DEPC水中，获得低分子量RNA溶液。优选的，上述步骤2中NaCl溶液的浓度为5M，聚乙二醇的体积浓度为50％。优选的，上述步骤3中于-20℃放置时间为2h，4℃、15000rpm离心时间为1h。优选的，上述步骤4中乙醇的体积浓度是80％。优选的，上述步骤4)中乙醇的体积浓度是80％。本专利技术还提供了一种有效的低分子量RNA分离纯化方法，在提取植物中低分子量RNA的应用。本专利技术还提供了一种有效的低分子量RNA分离纯化方法，在提取番茄中低分子量RNA的应用。本专利技术提供的一种有效的低分子量RNA分离纯化方法，克服了传统方法的缺陷，可以有效的分离出长度介于10-30nt的低分子量RNA，并且由本专利技术的方法分离出的低分子量RNA纯度和含量均较高。附图说明图1是利用本专利技术的方法提取中低分子量RNA的15％尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图。具体实施方式下面结合附图和具体实施方式对本专利技术进行详细说明，但应当理解本专利技术的保护范围并不受具体实施方式的限制。本专利技术提供的一种有效的小分子RNA分离纯化方法，包括以下步骤：步骤1，按Trizol法提取总RNA，获得总RNA溶液，用DEPC水将总RNA溶液的浓度调至1μg/μL；需要说明的是，Trizol法提取总RNA是本领域的常用方法，故此处不再赘述Trizol法的具体步骤。步骤2，取一定体积的总RNA溶液，分别加入相当于总RNA溶液1/10体积的40-60％聚乙二醇和相当于总RNA溶液1/10体积的4-6M NaCl溶液，混合均匀，冰浴30min，然后于4℃、15000rmp离心10min，收集上清液，其中40-60％聚乙二醇指的是聚乙二醇的体积浓度为40-60％。步骤3，向步骤2的上清液中加入相当于上清液2.5倍体积的无水乙醇，然后于-20℃放置2-3h，之后于4℃、15000rpm离心1-1.5h，弃去上清液，得到RNA沉淀物。步骤4，用体积浓度为75-80％的乙醇清洗RNA沉淀物2次，自然晾干，并将自然晾干后的RNA沉淀物溶于一定体积的DEPC水中，获得富集的RNA溶液。步骤5，制备聚丙烯酰氨质量分数为15％变性聚丙烯酰氨凝胶，并在200V电压下预电泳15-30min。需要说明的是，变性聚丙烯酰氨凝胶的具体制备步骤如下：步骤5.1，按照Bio-Rad垂直电泳玻璃板，1.5mm间隙(Mini-PROTEAN3，USA)，制备聚丙烯酰氨质量分数为15％变性聚丙烯酰氨凝胶，具体包括：9.6克尿素、7.5mL 40％(w/v)聚丙烯酰胺贮存液、2mL 10×TBE缓冲液、DEPC水补至20mL，混合均匀，于37℃加热溶解尿素，然后用膜孔直径为0.45μL的硝酸纤维素膜过滤，冷却至室温，得到混合液；步骤5.2，向混合液中加入120μL新鲜配制的10％过硫酸铵溶液，混合均匀，然后再加入9.2μL TEMED(四甲基乙二胺)，涡旋混匀，获得凝胶溶液，步骤5.3，向电泳玻璃板缝隙内灌入凝胶溶液直至顶部；步骤5.4，迅速插入梳子，室温下静置30min，使凝胶溶液凝固；步骤5.5，带凝胶溶液凝固后拔出梳子，胶孔用1×TBE缓冲液充分清洗干净。需要说明的是，应当用1×TBE缓冲液清洗胶孔，其中1×TBE缓冲液为5×TBE储存液稀释而得，每升5×TBE储存液的配制方法为：本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种有效的低分子量RNA分离纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1，按Trizol法提取总RNA，获得总RNA溶液，用DEPC水将总RNA溶液的浓度调至1μg/μL；步骤2，取一定体积的总RNA溶液，分别加入相当于总RNA溶液1/10体积的40‑60％聚乙二醇和相当于总RNA溶液1/10体积的4‑6M NaCl溶液，混合均匀，冰浴30min，然后于4℃、15000rmp离心10min，收集上清液；步骤3，向步骤2的上清液中加入相当于上清液2.5倍体积的无水乙醇，然后于‑20℃放置2‑3h，之后于4℃、15000rpm离心1‑1.5h，弃去上清液，得到RNA沉淀物；步骤4，用体积浓度为75‑80％的乙醇清洗RNA沉淀物2次，自然晾干，并将自然晾干后的RNA沉淀物溶于一定体积的DEPC水中，获得富集的RNA溶液；步骤5，制备聚丙烯酰氨质量分数为15％变性聚丙烯酰氨凝胶，并在200V电压下预电泳15‑30min；步骤6，配制一定体积的RNA样品点样溶液，所述RNA样品点样溶液按照以下步骤配制：步骤4中富集的RNA溶液和2×上样缓冲液，按1∶1的体积比涡旋混匀，65℃保温5‑10min，然后放于冰上保存备用；步骤7，配制一定体积的marker溶液，所述marker溶液按照以下步骤配制：2×上样缓冲液和包含10‑500nt的DNA marker，按1∶1的体积比涡旋混匀，65℃保温5‑10min，然后放于冰上保存备用；步骤8，将步骤6的RNA样品点样溶液和步骤7的marker溶液分别点样于变性聚丙烯酰氨凝胶中，200V电压下电泳1h，然后取出变性聚丙烯酰氨凝胶，并用浓度为1μg/μL的EB溶液浸泡染色5min，最后回收并纯化变性聚丙烯酰氨凝胶中的低分子量RNA，获得低分子量RNA溶液。...
【技术特征摘要】
1.一种有效的低分子量RNA分离纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1，按Trizol法提取总RNA，获得总RNA溶液，用DEPC水将总RNA溶液的浓度调至1μg/μL；步骤2，取一定体积的总RNA溶液，分别加入相当于总RNA溶液1/10体积的40-60％聚乙二醇和相当于总RNA溶液1/10体积的4-6M NaCl溶液，混合均匀，冰浴30min，然后于4℃、15000rmp离心10min，收集上清液；步骤3，向步骤2的上清液中加入相当于上清液2.5倍体积的无水乙醇，然后于-20℃放置2-3h，之后于4℃、15000rpm离心1-1.5h，弃去上清液，得到RNA沉淀物；步骤4，用体积浓度为75-80％的乙醇清洗RNA沉淀物2次，自然晾干，并将自然晾干后的RNA沉淀物溶于一定体积的DEPC水中，获得富集的RNA溶液；步骤5，制备聚丙烯酰氨质量分数为15％变性聚丙烯酰氨凝胶，并在200V电压下预电泳15-30min；步骤6，配制一定体积的RNA样品点样溶液，所述RNA样品点样溶液按照以下步骤配制：步骤4中富集的RNA溶液和2×上样缓冲液，按1∶1的体积比涡旋混匀，65℃保温5-10min，然后放于冰上保存备用；步骤7，配制一定体积的marker溶液，所述marker溶液按照以下步骤配制：2×上样缓冲液和包含10-500nt的DNA marker，按1∶1的体积比涡旋混匀，65℃保温5-10min，然后放于冰上保存备用；步骤8，将步骤6的RNA样品点样溶液和步骤7的marker溶液分别点样于变性聚丙烯酰氨凝胶中，200V电压下电泳1h，然后取出变性聚丙烯酰氨凝胶，并用浓度为1μg/μL的EB溶液浸泡染色5min，最后回收并纯化变性聚丙烯酰氨凝胶中的低分子量RNA，...
【专利技术属性】
技术研发人员：许冬倩，李会宣，
申请(专利权)人：河北经贸大学，
类型：发明
国别省市：河北;13
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