染料的光敏化化学漂白制造技术

本发明专利技术提供包括使用光敏化化学漂白以在生物样品中检测多靶标的方法。所述方法包括提供包含多靶标的生物样品，使至少一个探针结合存在于样品中的一个或多个靶标，和检测来自探针的信号的步骤。所述方法还包括使包含结合的探针的样品与电子转移试剂以及在光敏化化学漂白期间防止靶标修饰的任选的添加剂接触并照射样品，由此启动通过光敏化化学漂白基本上灭活探针的光反应的步骤。所述方法还包括使至少一个探针结合存在于样品中的一个或多个靶标，并检测来自探针的信号的步骤。结合、检测和漂白的过程可以反复重复。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】染料的光敏化化学漂白专利
本专利技术涉及生物样品中生物标志物的检测。更具体地，本专利技术涉及在检测生物样品中的多靶标的方法中采用光敏化化学漂白，包括任选采用添加剂，因而防止光敏化化学漂白过程期间的靶标修饰。还提供用于进行该新方法的试剂盒和系统，以及采用该新方法生成的生物样品的图像。背景多种方法可用于生物学和医学中，以检测生物样品中的不同靶标。例如，组织切片和其它细胞学制品中的蛋白质分析可使用组织化学、免疫组织化学(IHC)或免疫荧光的技术进行。生物样品的蛋白质分析还可使用固态免疫测定法例如使用蛋白质印迹技术或使用可例如通过使用流式细胞术进行的基于细胞的测定法进行。许多现有技术一次仅可检测单一样品中的几个靶标(例如IHC或基于荧光的蛋白质印迹，其中可检测的靶标数量受到基于荧光的检测系统的限制)。靶标的进一步分析可需要使用来自所述来源的额外生物样品，这限制了测定靶标的相对特征(例如生物样品中多个生物靶标的存在、不存在、浓度和/或空间分布)的能力。此外，在某些情况下，可能可获得有限量的样品以供分析之用或所述单个样品可能需要进一步的分析。重复分析单个样品的方法描述于美国专利号7,629,125和美国专利号7,741,046中。特别地，美国专利号7,741,046提供检测生物样品中的多靶标的方法，其包括使用氧化以灭活信号发生器(例如，漂白荧光染料)。氧化反应通过使用氧化剂例如过氧化氢完成。此外，通过使信号发生器连续曝光于照射，即通过光漂白，可灭活信号。类似于通过氧化的信号灭活，这个过程可能是漫长的，并且可能不进行至完成，导致信噪比减少。此外，使样品连续曝光于照射可损害生物样品。然而，这些现有方法有时确实影响蛋白表位，在此情况下，这些表位必须在第一轮中被检测，或者必须采用替代表位或下游途径蛋白的抗体来研究其对疾病的作用。在一些情况下，对于后续数轮测试的靶标，抗原性进一步增强，防止有意义的表达比较。采用清除剂清除自由基、单线态氧的概念是已知的。然而，该概念并未用于针对生物样品的信号循环。Freeradicalsandsingletoxygenscavengers:Reactionofaperoxy-radicalwithβ-carotene,diphenylfuranand1,4-diazobicyclo(2,2,2)-octane(自由基和单线态氧清除剂：过氧自由基与β-胡萝卜素、联苯呋喃和1,4-重氮二环(2,2,2)辛烷的反应),BiochemicalandBiophysicalResearchCommunication,Volume98,Issue4,1981年2月27日,901–906页。OxygenScavengersandSensitizersforReducedOxygenInhibitioninRadicalPhotopolymerization(用于在自由基光聚合中减少氧抑制的氧清除剂和敏化剂)JournalofPolymerSciencePartA:PolymerChemistry,Volume46,Issue20,6916。ReducedPhotobleachingofConjugatedPolymerFilmsthroughSmallMoleculeAdditives(通过小分子添加剂减少共轭聚合物膜的光漂白),Macromolecules2008,41,8306-8308。因此，仍存在用于连续分析生物学靶标的快速、更温和且更灵敏的方法的需求。简述本文公开新的用于高通量多路复用样品分析的方法。所述方法采用，例如信号循环过程，其中在各个循环中，光反应步骤允许相同的信号发生器例如荧光团重复用于随后的循环中以检测另外的标记物，例如蛋白质。可采用这些方法，例如用于连续地分析生物样品，以尤其辨别生物样品中多个生物靶标的存在、不存在、浓度和/或空间分布。光反应步骤可包括应用电子转移试剂，例如硼酸盐，并启动光反应，例如，通过用可见光照射样品，以灭活信号发生器，例如，荧光染料。光反应步骤可进一步包括防止由光反应副产物，例如自由基和单线态氧引起的靶标修饰的添加剂。在一些实施方案中，所公开方法的优点可包括在各个循环中迅速破坏信号。例如，在一些例子中，与常规方法中超过15分钟相比，在约100毫秒内观测到猝灭。在一些实施方案中，所公开的方法还可表征为甚至在例如导致信噪比增加的高表达靶标中缺乏残留的荧光。此外，所公开的方法不损害生物样品或其成分，例如，抗原决定部位，以致相同的样品可以在许多循环中使用。同样，在一些实施方案中，当与荧光染料的直接光漂白作用比较时，所公开的方法是有利的，因为它们不需要可损害生物样品成分的高功率光。在一些实施方案中，本专利技术是一种探测生物样品中的多靶标的方法，其包括：(a)使至少一个探针结合存在于包含多靶标的生物样品中的一个或多个靶标；(b)检测来自步骤(a)中结合的至少一个探针的信号；(c)使包含步骤(a)的结合探针的样品与电子转移试剂和防止步骤(d)期间靶标修饰的添加剂接触；(d)照射步骤(c)的样品；(e)使至少一个探针结合存在于步骤(d)的样品中的一个或多个靶标；和(f)检测来自步骤(e)中结合的探针的信号。在一些实施方案中，步骤(a)中的探针包含光信号发生器，和步骤(b)中检测到的信号是光信号。在另外的实施方案中，光信号发生器是荧光信号发生器，和在步骤(b)中检测到的光信号是荧光信号。在一些实施方案中，步骤(a)包括使一个以上的探针结合两个或更多个靶标。在一些实施方案中，步骤(d)中照射样品在缓冲剂的存在下进行。在一些实施方案中，照射在pH5-9下进行。在一些实施方案中，照射在pH6-8下进行。在一些实施方案中，步骤(d)中照射样品在4-50℃的温度下进行。在优选的实施方案中，照射样品在20-30℃的温度下进行。在一些实施方案中，步骤(d)中照射样品通过使样品暴露于350nm-1.3μM波长的光来完成。在一些实施方案中，照射样品通过使样品暴露于400-700nm波长的光来完成。在一些实施方案中，电子转移试剂是硼酸盐。在一些实施方案中，硼酸盐由以下结构式表示：,其中：R1、R2和R3各自独立地是烷基、烯基、炔基、芳基或杂芳基，其中烷基、烯基、炔基、芳基或杂芳基任选地被一个或多个选自以下的取代基取代：(C1-C4)烷基、(C1-C4)烷氧基、(C1-C4)烷基氨基、氨基、羟基、氰基、卤素或硝基，R4是烷基、烯基或炔基，其中烷基、烯基或炔基任选地被一个或多个选自以下的取代基取代：(C1-C4)烷基、(C1-C4)烷氧基、(C1-C4)烷基氨基、氨基、羟基、氰基、卤素或硝基，和M+选自有机和无机阳离子。在一些实施方案中，R1、R2和R3各自是芳基。在一些实施方案中，芳基是苯基。在一些实施方案中，苯基是未取代的苯基。在一些实施方案中，R4是任选取代的烷基。在一些实施方案中，R4为未取代的丁基。在一些实施方案中，R1、R2和R3各自是任选取代的芳基和R4是任选取代的烷基。在进一步的实施方案中，R1、R2和R3各自为未取代的苯基和R4为未取代的丁基，和硼酸盐为三苯基丁基硼酸盐。在一些实施方案中，电子转移试剂是高水溶性硼酸盐。在一些实施方案中，高水溶性硼酸盐是聚乙二醇化硼酸盐。在其它实施本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种探测生物样品中的多靶标的方法，其包括：(a) 使至少一个探针结合存在于包含多靶标的生物样品中的一个或多个靶标；(b) 检测来自步骤(a)中结合的至少一个探针的信号；(c) 使包含步骤(a)的结合探针的样品与电子转移试剂和防止以下步骤(d)中靶标修饰的添加剂接触；(d) 照射步骤(c)的样品；(e) 使至少一个探针结合存在于步骤(d)的样品中的一个或多个靶标；和(f) 检测来自步骤(e)中结合的探针的信号。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2012.12.11 US 61/7355861.一种探测生物样品中的多靶标的方法，其包括：(a)使至少一个探针结合存在于包含多靶标的生物样品中的一个或多个靶标；(b)检测来自步骤(a)中结合的至少一个探针的信号；(c)使包含步骤(a)的结合探针的样品与电子转移试剂和防止以下步骤(d)中靶标修饰的添加剂接触；(d)照射步骤(c)的样品；(e)使至少一个探针结合存在于步骤(d)的样品中的一个或多个靶标；和(f)检测来自步骤(e)中结合的探针的信号，其中所述探针包含光信号发生器，和其中防止靶标修饰的添加剂是自由基清除剂或单线态氧的淬灭剂，其中电子转移试剂是由以下结构式表示的硼酸盐：,其中：R1、R2和R3各自独立地是烷基、烯基、炔基、芳基或杂芳基，其中所述烷基、烯基、炔基、芳基或杂芳基任选地被一个或多个选自以下的取代基取代：(C1-C4)烷基、(C1-C4)烷氧基、(C1-C4)烷基氨基、氨基、羟基、氰基、卤素或硝基，R4是烷基、烯基或炔基，其中所述烷基、烯基或炔基任选地被一个或多个选自以下的取代基取代：(C1-C4)烷基、(C1-C4)烷氧基、(C1-C4)烷基氨基、氨基、羟基、氰基、卤素或硝基，和M+选自有机和无机阳离子。2.权利要求1的方法，其中步骤(b)中检测到的信号是光信号。3.权利要求2的方法，其中步骤(a)的探针包含荧光信号发生器，和步骤(b)中检测到的信号是荧光信号。4.权利要求1的方法，其中步骤(d)中照射样品在pH5-9的缓冲剂的存在下进行。5.权利要求1的方法，其中步骤(d)中照射样品通过使样品暴露于350nm-1.3μM波长的光而完成。6.权利要求5的方法，其中步骤(d)中照射样品通过使样品暴露于400-700nm波长的光而完成。7.权利要求1的方法，其中R1、R2和R3各自是任选取代的芳基和R4是任选取代的烷基。8.权利要求7的方法，其中R1、R2和R3各自为未取代的苯基和R4为未取代的丁基，和硼酸盐为三苯基丁基硼酸盐。9.权利要求1的方法，其中所述探针是形态学染色剂。10.权利要求3的方法，其中电子转移试剂是高水溶性硼酸盐。11.权利要求10的方法，其中高水溶性硼酸盐是四正丁基硼酸盐、苯基-三-2-(4-甲氧基PEG(10)甲基苯基)乙基硼酸盐或二苯基-双-2-(4-(甲氧基PEG(10)甲基)苯基)乙基硼酸盐。12.权利要求1的方法，其中步骤(c)-(f)重复一次或多次。13.权利要求1的方法，其中步骤(c)和(d)进行100毫秒至15分钟。14.权利要求1的方法，其还包括在步骤(d)之后，用有效从样品中去除残余电子转移试剂的洗涤溶液洗涤样品。15.权利要求14的方法，其中所述洗涤溶液包含促成剂，其中所述促成剂是指加入洗涤溶液中而有助于在去除信号后从样品去除残余电子转移试剂的物质。16.权利要求1的方法，其中步骤(a)的探针和步骤(e)的探针各自包含信号发生器，其中步骤(a)中的信号发生器不同于步骤(e)中的信号发生器。17.权利要求1的方法，其中步骤(d)中样品的照射启动通过光敏化化学漂白灭活信号发生器的光反应。18.权利要求1的方法，其中在步骤(d)之后未检测到可检测的信号。19.权利要求1的方法，其中防止靶标修饰的添加剂是自由基清除剂。20.权利要求19的方法，其中自由基清除剂选自抗坏血酸、没食子酸正丙酯、巯基乙醇、盐酸半胱氨酸、叔丁基羟基甲苯、环庚三烯、邻苯二甲酸二辛酯、1,4-二氢-o-甲苯酰胺、α-生育酚和trolox。21.权利要求1的方法，其中防止靶标修饰的添加剂是单线态氧的淬灭剂。22.权利要求21的方法，其中单线态氧的淬灭剂选自抗坏血酸、α-生育酚、姜黄素和DABCO。23.一种探测生物样品中的多靶标的方法，其包括：(a)使多个探针结合存在于包含多靶标的生物样品中的多靶标，其中多个探针包括第一组探针和第二组探针；(b)检测来自步骤(a)中结合的第一组探针的第一组信号；(c)使包含步骤(a)的结合探针的样品与电子转移试剂和防止以下步骤(d)中靶标修饰的添加剂接触；(d)照射步骤(c)的样品；(e)自步骤(a)中结合的第二组探针生成第二组信号；(f)检测第二组信号，其中所述探针包含光信号发生器，和其中防止靶标修饰的添加剂是自由基清除剂或单线态氧的淬灭剂，其中电子转移试剂是由以下结构式表示的硼酸盐：,其中：R1、R2和R3各自独立地是烷基、烯基、炔基、芳基或杂芳基，其中所...

【专利技术属性】
技术研发人员：A纳塔拉彦，RJ费尔金斯，A苏德，LS卡努马勒，KA谢赫，C罗维斯，
申请(专利权)人：克拉里安特诊断服务公司，
类型：发明
国别省市：美国;US